一种重组人淀粉样蛋白Aβ<SUB>42</SUB>的制备方法及应用

摘要

一种重组人淀粉样蛋白Aβ₄₂的制备方法及应用，属于融合蛋白技术领域。本发明根据人淀粉样蛋白前体蛋白APP的序列和克隆载体pGEX－4T－1多克隆位点，设计人淀粉样蛋白Aβ₄₂的PCR上游引物P₁，引入BamHI酶切位点，下游引物P₂，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG。利用RT－PCR技术，以人SH－SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp，编码人APP从672到713的Aβ₄₂片段。将Aβ₄₂基因片段序列重组于原核表达载体pGEX－4T－1，构建表达人Aβ₄₂的原核表达质粒pGEX－4T－1/Aβ₄₂。将pGEX－4T－1/Aβ₄₂转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达、分离和酶切，得到纯化的有活性的重组人淀粉样蛋白Aβ₄₂。

主权项

1、一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法，其特征在于步骤为：步骤一：原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42的构建(1)获得cDNA：提取人神经瘤母细胞SH-SY5Y总RNA，以oligo(dT)为引物，反转合成获得SH-SY5Y细胞cDNA；(2)引物设计及PCR：检索genbank，依据人淀粉样蛋白Aβ42的序列和载体pGEX-4T-1的多克隆位点设计引物：上游引物P1：5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，引入BamHI酶切位点；下游引物P2：5’-ACGCGTCGACCTACGCTATGACAACACCGCCCA-3’，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG；以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp；(3)将上述(2)所得PCR产物及载体pGEX-4T-1进行BamHI和SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用T4连接酶连接，连接产物转化入CaCl2处理的新鲜制备的DH5α感受态菌中，混匀后置冰中2分钟，37℃培养1小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基中，37℃培养过夜，挑取阳性单菌落克隆；(4)提取阳性单菌落克隆中的质粒，经测序鉴定为重组的人淀粉样蛋白原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42；将此重组质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入DH5α菌株扩增保种；并提取质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，即成Aβ42的原核表达菌株pGEX-4T-1/Aβ42/BL21；步骤二：GST-Aβ42融合蛋白的原核表达及纯化(5)GST-Aβ42融合蛋白的表达：已构建好的pGEX-4T-1/Aβ42/BL21表达菌株37℃培养4h，按1∶100接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃振摇培养至OD600为1.0～1.2，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，诱导表达2小时，40,000×g离心15min，收集菌体；95℃煮沸5min，SDS-PAGE电泳，GST及Aβ42抗体的Western blot分析证实表达菌中有GST-Aβ42融合蛋白表达；(6)GST-Aβ42融合蛋白的纯化：每2克菌体以15mL pH 7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液重悬，冰上超声裂解，超声条件为：超5s，停20s，共20分钟；12,000×g离心20min，收集上清，挂Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，经PBS磷酸盐缓冲液充分洗涤后，以10mM还原性谷胱甘肽溶液洗脱GST-Aβ42 融合蛋白，收集洗脱液，即得到纯化的GST-Aβ42融合蛋白；(7)GST-Aβ42融合蛋白的Western bloting鉴定：将上述GlutathioneSepharose 4B亲和层析洗脱样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Westernbloting分析，证实该蛋白为GST-Aβ42融合蛋白；步骤三：Aβ42蛋白的酶切及鉴定(8)Aβ42蛋白酶切纯化：纯化得到的GST-Aβ42融合蛋白经10U凝血酶/mg融合蛋白，在pH 7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液体系中于23℃反应16小时，再依次经Glutathione Sepharose 4B亲和柱去除酶切下的GST蛋白，苯甲脒柱去除凝血酶，得到纯的Aβ42蛋白；(9)Aβ42蛋白的Western bloting鉴定：将上述(8)经酶切及双亲和纯化得到的Aβ42蛋白样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Western bloting鉴定，结果显示所得蛋白仅能与抗Aβ42抗体反应，而不能与抗GST抗体反应，证实该蛋白为Aβ42蛋白；(10)Aβ42蛋白聚集分析：利用能与淀粉样结构特异结合的荧光物质硫磺素-T分析Aβ42蛋白在体外聚集的性质，取30μM纯的Aβ42蛋白溶于pH 7.4、50mMPBS磷酸盐缓冲液，取两亇样本分别置于-20、37℃孵育7天，孵育结束，各组取3.6μL孵育液和120μL用pH 6.0、50mM PBS磷酸盐缓冲液新鲜配制的3.0μM硫磺素-T溶液充分混合，在激发光418nm和发射光486nm下测量荧光强度；结果显示：纯化得到的Aβ42蛋白在37℃下形成聚集体。