多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用

摘要

本发明公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用。在充满氮气的厌氧箱内制作以多环芳烃为唯一碳源和能源、以硝酸钠或硝酸钾为电子受体的厌氧琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有多环芳烃厌氧降解混合菌的厌氧琼脂固体培养基顶层平板，将制作好的培养基平板密封后放入充满氮气的干燥器中培养1～2月。在充满氮气的厌氧箱内向加入多环芳烃、电子受体、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及刃天青的厌氧瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为20±2℃、转速为100r/min的振荡器中培养20～25天。然后进行循环转接，在循环次数大于4次后即可得到能够厌氧降解多环芳烃的纯菌种。本方法能够分离纯化得到对多环芳烃厌氧降解性能好的微生物纯菌种。

主权项

1.一种多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：(1)向体积为150～200mL的厌氧瓶内加入99mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液、0.1mL刃天青溶液，用高纯氮气曝气3.5h后加入50～60mg Na2S除去残余的氧，然后用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧；其中基础培养基的组成为：NH4Cl：1.2g·L-1，KH2PO4：1.2g·L-1，MgCl2：0.15g·L-1，CaCl2·2H2O：0.05g·L-1；微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O：30mg·L-1，CuCl2：0.15mg·L-1，H3BO3：5.7mg·L-1，MnCl2·4H2O：20mg·L-1，Na2MoO4·2H2O：2.5mg·L-1，NiCl2·2H2O：1.5mg·L-1，ZnCl2：2.1mg·L-1。(2)在充满氮气的厌氧手套箱内向体积为80～100mL的厌氧瓶内加入50mL按步骤(1)配制的液体培养基、0.25～0.30g电子受体和0.65g琼脂，用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧。然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至60℃左右时，在充满氮气的厌氧手套箱中将其倒入体积为160mL的培养皿中，将该培养皿在充满氮气的厌氧手套箱中放置2天。(3)在充满氮气的厌氧手套箱内向步骤(2)中的培养皿中加入0.3mL浓度为2g/L的多环芳烃丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使多环芳烃的丙酮溶液均匀分布，将该培养皿在充满氮气的厌氧手套箱中放置2天。(4)在充满氮气的厌氧手套箱内向体积为20～25mL的厌氧瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.25g琼脂，用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧。然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至36～38℃。(5)在充满氮气的厌氧手套箱中向步骤(4)的厌氧瓶中加入1mL通过富集与驯化筛选得到的多环芳烃厌氧降解菌群溶液，摇匀后吸取1mL慢慢加入步骤(3)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使接种有混合菌群的培养基溶液均匀分布。密封培养皿并将其放入充满氮气的干燥器中培养观察，1～2月后便可发现有明显的菌落出现。(6)在充满氮气的厌氧手套箱内向体积为20～25mL的厌氧瓶中加入2.5～3.0mL浓度为2g/L的多环芳烃丙酮溶液，，将厌氧瓶开口放置2天后，加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.05～0.06g电子受体。(7)在充满氮气的厌氧手套箱内挑取步骤(5)培养皿中的菌落，将其接种至步骤(6)中的厌氧瓶中，用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧，在温度为20±2℃、转速为100r/min的振荡器中培养20～25天。(8)将步骤(2)至步骤(7)作为一个分离纯化周期；重复步骤(2)至步骤(7)，但每次用前一个分离纯化周期中步骤(7)的菌液代替步骤(5)中用到的多环芳烃厌氧降解菌群溶液。分离纯化四个周期以上即可得到能够厌氧降解多环芳烃的纯菌种。