一种古代人类遗存物质DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种古代DNA的提取方法，该方法采用等离子体等处理骨骼样品，使骨骼样品的内表面的有机污染物质被分解，快速清除骨骼样品的表面和内表面污染，然后进行DNA的提取；包括打磨骨骼样品表面，次氯酸处理，紫外照射，70％乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染，进一步用Ar/O₂(9∶1)离子体处理样品，最后在液氮中研磨成粉末作为提取样品。样品消化裂解后，通过分三步完成的酚氯仿抽提方法去除被消化掉的有机分子，通过采用二氧化硅吸附柱吸附及超滤离心管(3kDa)过滤，得到古代DNA模板。本发明的方法能极快对表面和内表面污染进行有效的清除。显著提高了古代DNA提取成功率及模板含量。

主权项

1.一种古代人类遗存物质DNA的提取方法，其特征在于，该方法具体包括下列步骤：步骤一，对打磨表面后经次氯酸处理表面的骨骼或者牙齿样品进行紫外线照射30min，然后用70％的乙醇洗涤两次，去除外源微生物DNA污染；步骤二，将骨骼或者牙齿样品放置在等离子体处理反应器中，采用外电极和射频功率发生器进行流动式射频放电，放电时间1～10min；同时在等离子体处理反应器中加入Ar/O2为9∶1的等离子体对骨骼或者牙齿样品处理，处理后的骨骼或者牙齿样品从等离子体处理反应器中取出，在空气中放置10min，然后进行古DNA提取；步骤三，液氮处理骨骼或者牙齿样品，把骨骼或者牙齿样品研磨成粉末，作为DNA提取样品；步骤四，取DNA提取样品，加入提取缓冲液5ml，于37℃振荡过夜；所述的提取缓冲液的配方为：50mM的Tris，pH8.0，0.2M的EDTA，pH8.0，1mM的NaCl，1.2mg/ml的DTT，0.5％SDS，500μg/ml的蛋白酶K；过夜后的DNA提取样品转入空气浴内振荡，然后于55℃继续振荡温育6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活；步骤五，2500rpm离心10min，吸出上清液，移入至另一经消毒的50ml离心管中；步骤六，分别用和上清液等体积的平衡酚、苯酚/氯仿、氯仿/异戊醇三种溶剂依次各抽提一次，每次都取上层溶液，合并抽提液，振荡10min，然后于2500rpm离心5min，得到上清液；步骤七，将上清液置于真空旋转蒸发仪中浓缩至300μl，加入等体积100％冰乙醇，充分混匀，将其加入二氧化硅吸附柱，于12000rpm离心30s，弃掉废液，得到含有遗存物质DNA的溶质；步骤八，用500μl的80％冰乙醇对溶质漂洗两次，12000rpm离心2min，然后于室温下放置10min，使残留的乙醇完全挥发；步骤九，将二氧化硅吸附柱转入一个经消毒的离心管中，加入160μlTE洗脱液，在60～70℃水浴中预热，室温放置5min，12000rpm离心30s，保留洗脱液；步骤十，将洗脱液再次加入二氧化硅吸附柱中，室温放置10min，12000rpm的离心机中离心30s，保留洗脱液；步骤十一，将步骤十的洗脱液转入1.5ml超滤离心管中，于5000rpm离心10min；离心后向超滤离心管中加入100μlTE缓冲液，室温放置2min，收集洗脱液，即为含有古DNA片段的溶液。