一种同时检测靶基因序列及已知点突变的新技术

摘要

本发明利用独特设计的一对单荧光素标记的引物，在荧光PCR仪器或普通PCR仪加荧光读板机中进行PCR或RT－PCR反应，根据荧光值的变化实现对特定靶序列的定性或定量检测，并同时在扩增产物中引入特定的限制性内切酶位点，通过随后的一个酶切过程，检测酶切过程中荧光值的变化，实现对靶序列上点突变的检测。

主权项

1.本发明涉及一种同时检测靶基因序列及已知点突变的方法，其特征在于，在按本发明所述的方法设计得到的一对经过人为改造的单荧光标记的引物存在下，在荧光PCR仪中或普通PCR仪加荧光读板机，对从特定样本中提取的DNA或RNA进行PCR或RT-PCR扩增，实现对特定靶序列的定性或定量检测，并同时在扩增产物中引入特定的限制性内切酶位点，通过随后的一个酶切过程，检测酶切过程中荧光值的变化，实现对靶序列上已知点突变的检测；所述的一对单荧光标记引物的设计原则及实验过程如下：(1).这对单荧光素标记的引物，即上下游引物，引物长度在15～30碱基之间，分别与靶序列的负义链和正义链互补，一对引物上在不影响DNA链延伸或PCR后酶切的前提下可分别在任意位置标记不同的荧光素，两种荧光素之间能发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)。(2).这对引物与靶序列互补后，其3’端之间间隔1个碱基以上，相距长度以在扩增过程中引入点突变碱基和保证荧光基团间有荧光共振能量转移(FRET)为原则。(3).其中任意一条引物的3’末端根据发生点突变碱基的多态性引入或不引入人为改造的碱基，使之和突变碱基或野生型碱基形成一个特定的限制性内切酶位点，反之，该位置野生型碱基或突变碱基则不能形成该特定限制性内切酶位点。根据点突变碱基的多态性，针对不同的靶序列，对不同的引物3’末端进行不同的改造，使之形成不同的限制性内切酶位点。(4).根据上述原则设计的单荧光素标记的引物，和PCR反应缓冲液，Mg2+ 溶液，dNTPs，Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶/逆转录酶等成分配制成PCR反应液或RT-PCR反应液，加入从特定的样本中提取的DNA或RNA，在荧光PCR仪器上进行PCR或RT-PCR扩增反应，同时测定荧光值的变化，对样本中是否存在靶序列作出定性或定量判断。(5).PCR结束后，在PCR产物中加入特定的限制性内切酶，保温反应，同时测定荧光值的变化，根据荧光值的变化情况，对靶序列中是否存在点突变作出判断。