用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法。该方法放弃原有的合成路线即衍生化后重结晶的方法，而采用直接合成，并用高效柱层析方法在引入6－羟基己基后直接进行异构体分离。本发明的方法可以大大缩短生产周期，降低人力投入，成倍地提高反应收率，从而大幅度地降低这类标记生物大分子用荧光染料的成本。

主权项

1、一种用于定量PCR的荧光染料的新的制备方法，依次包括如下步骤：A.间苯二酚与偏苯三甲酸酐在200℃左右的温度下缩合，形成5(6)-羧基荧光素；B.5(6)-羧基荧光素上的两个羟基用特戊酰基进行保护形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素；C.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素用N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，形成二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯；D.二特戊酰基-5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯与6-氨基己醇反应生成二特戊酰基-5(6)-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；E.用高效柱层析方法在引入6-羟基己基后直接进行异构体分离，得到二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素；F.用磷酸化试剂磷酸化二特戊酰基-6-N-(6’-羟基己基)-羰酰胺基荧光素。