| 主权项 |
1.一种利用胚胎质制造治疗癌细胞药物之方法,其包括下列步骤:(a)分离出一胚胎质;以及(b)将该分离出之胚胎质与一赋形剂相混合,以得到该药物。2.如申请专利范围第1项所述之利用胚胎质制造治疗癌细胞药物之方法,其中该胚胎质在SDS-PAGE上,63 Kd的位置显示出一明显的单一蛋白质色带。3.如申请专利范围第1项利用胚胎质制造治疗癌细胞药物之方法,其中该胚胎质可由以下步骤分离:(a)混合100毫升胚胎牛血清和200毫升含30%(V/V)乙醇的0.05M醋酸锌,使用1M氢氧化铵-氯化铵将酸硷値调至6.4,并且令此混合物在-5℃下静置15小时;(b)利用离心法收集悬浮物,加入1.0 M的醋酸钡和95%的乙醇,令此混合物在-5℃下静置2小时;(c)利用离心法收集悬浮物,加入95%的乙醇,令此混合物在-10℃下静置15小时;以及(d)收集沈淀物,并且利用磷酸盐缓冲食盐水溶解沈淀物。4.如申请专利范围第1项所述之利用胚胎质制造治疗癌细胞药物之方法,其中该癌细胞为摄护腺癌细胞,血癌细胞,乳癌细胞,结肠癌细胞,及肺癌细胞其中之一。图式简单说明:第1图:XC细胞调理培养基诱发前列腺癌(LNCaP细胞)发生细胞自杀现象。LNCaP细胞会以控制组培养基或调理培养基培养15个小时,然后再以赫司特染剂染色2个小时。如第1(A)图所示,以控制组培养基培养的LNCaP细胞之细胞核显得非常正常和健康(第1(A)图)。然而,以调理培养基(X20,更换为RPMI)培养的LNCaP细胞之细胞核则显现出细胞自杀的特征(第1(B)图)。首先,调理过的培养基造成细胞核凝集,与控制组的细胞核(第1(A)图)比较,它会呈现出更强烈的萤光。再者,细胞核凝结也会并同去氧核糖核酸的断裂,细胞核的断裂如同第1(B)图所示。就如同我们稍早所曾提及的一般,细胞核凝集和去氧核糖核酸断裂,乃是细胞正値自杀阶段的两种型态特色。这些结果显示源自XC细胞的调理培养基具有会诱发LNCaP细胞自杀的活性。第2图:XC调理培养基并不会让正常的肺纤维母细胞(CCD 39 Lu细胞)发生细胞自杀的情况。以控制组培养基或调理培养基培养CCD 39 Lu细胞15小时,然后再以赫司特染剂染色2小时,如第1图所示。细胞显得非常正常且健康;不管是否使用XC细胞调理培养基(第2(A)图及第2(B)图)培养,CCD 39 Lu细胞仍然保持原样。第3图:利用阴离子(Q2)交换色层分析法来分离细胞自杀因子P-1。被硫酸铵分离的溶解蛋白质被浓缩,并加到Q2色层分析管(Bio Rad)中;Q2色层分析管乃是利用BioRad's BioLogic HPLC系统,藉由缓冲溶液A(10mM TiS-HC1,酸硷値7.4)和缓冲溶液B(10mMTriS-HC1,酸硷値7.4,0.55M氯化钠)所构成之线性梯级进一步发展而成。线性梯级乃是在10分钟内,渐次将0%至100%的缓冲溶液B加到缓冲溶液A中所构成(20毫升的洗出容积,然后再以100%的缓冲溶液B洗清管子5分钟)。细胞自杀因子P-1的活性,可以藉由诱发LNCaP细胞发生细胞自杀以分析之。我们发现在色层分析剖面图上出现三个活性尖峰。在18个小时内,第5~7部份造成70%的细胞死亡,第8~10部份造成65%的细胞死亡,以及第11~14部份造成90%的细胞死亡。我们收集第5~7部份,并且将之命名为细胞自杀因子P-1a,第8~10部份名为细胞自杀因子P-1b,而第11~14部份名为细胞自杀因子P-1c。这三种P-1细胞自杀因子可藉由逆相色层分析管再进一步加以纯化。第4图:逆相色层分析法可以被用来分离各种不同的细胞自杀因子P-1。细胞自杀因子P-1a、细胞自杀因子P-1b、细胞自杀因子P-1c分别被浓缩成1.5毫升。然后加入一毫升含有0.05%三氟醋酸的甲醇。经由此种处理方法,每一种检体都会出现大量的蛋白质沉淀物。然而,此时悬浮物仍然具有诱发细胞自杀的活性。之后,再将悬浮物施用到逆相色层分析管RP-4中(迈可拉科学公司),然后再利用溶液A(水、0.05%三氟醋酸)和溶液B(甲醇、0.05%三氟醋酸)所构成的线性梯级加以发展。线性梯级乃是在10分钟内,渐次将0%至100%的溶液B添加到溶液A中所构成(20毫升的洗出体积,然后再以100%的溶液B清洗色管五分钟。)细胞自杀因子P-1a之逆相色层分析图如第4(A)图。第12~13部份具有在10小时内让80%的LNCaP细胞发生细胞自杀的活性。细胞自杀因子P-1b之逆相色层分析图如第4(B)图。第14~15部份具有在18小时内诱发45%的LNCaP细胞自杀之活性。细胞自杀因子P-1C之逆相色层分析图如第4图c。第5部份具有在18小时内诱发52%的LNCaP细胞发生细胞自杀的活性。被分离的细胞自杀因子P-1a、细胞自杀因子P-1b以及细胞自杀因子P-1c之纯度,可以利用SDS-polyacrylamide胶质电泳法加以检验,并且利用银(色)染剂加以染色。第5图:利用阴离子交替色层分析法和逆相色层分析法所分离出来的细胞自杀因子P-1a会被浓缩,电泳池中并且透过4-20%梯级的Tri-Gly SDS-polyacrylamide胶质之变质作用。胶质会染上银色。如此会得到分子量70 KD的主要蛋白质色带。这项结果显示在SDSPA上呈现分子量70 KD图谱的细胞自杀因子P-1C之分离接近成功。第6图:利用阴离子交换色层分析法、逆相色层分析法和预备电泳法分离的细胞自杀因子P-1会被浓缩,并且透过SDS-polyacrylamide电泳法的10%的溶解胶质和4%堆叠胶质之非变质情况。胶质会染上银色。并且会得出分子量70 KD的蛋白质带(第6(A)图)。这种结果显示利用逆相色层分析法成功地分离细胞自杀因子P-1c,而且它亦会在SDSPAGE呈现出分子量70KD的图谱。利用预备电泳法来纯化细胞自杀因子P-1c,则会导致分离出分子量57 KD的蛋白质(第6(B)图)。此时尚难以排除这两种蛋白质其实是具有不同部份长度的同一种蛋白质之可能性。第7图:利用C3H 10T1/2细胞之调理培养基来诱使前列腺癌细胞(LNCaP细胞)发生细胞自杀的情况。以控制组培养基或调理培养基培养LNCaP细胞15个小时,然后再以赫司特染剂染色2个小时。如同第7(A)图所示,以控制组培养基培养的LNCaP细胞之细胞核显得正常且健康(A)。然而,以调理培养基(X 20,更换成RPMI)培养的LNCaP细胞之细胞核,则出现细胞自杀的特征(第7(B)图)。首先,调理培养基会造成细胞核凝集,与第7(A)图的控制组相较,它会呈现出较强烈的萤光。再者,细胞核的凝集也会伴随去氧核糖核酸的断裂,细胞核分裂的情况如第7(B)图。就如同我们稍早所曾提及的一样,细胞核凝集和去氧核糖核酸断裂乃是细胞正値自杀阶段的型态特色。这些结果显示源自XC细胞的调理培养基,具有诱使LNCaP细胞发生自杀的活性。第8图:C3H 10T1/2调理培养基并不能诱使正常的肺纤维母细胞(CCD 39 Lu细胞)发生自杀的情况。以控制组培养基或调理培养基培养15个小时,然后再使用赫司特染剂染色2小时。如第1图所示,细胞看似正常且健康;不论是否使用C3H 10T1/2细胞之调理培养基培养,CCD 39 Lu细胞的细胞核都仍然一样(第8(A)图及第8(B)图)。这项结果显示C3H 10T1/2调理培养基并不能诱使正常的肺纤维母细胞发生细胞自杀。第9图:细胞自杀因子P-2的逆相色层分析法。利用DE52纤维素、羟基磷灰石和肝素琼质糖所分离出的细胞自杀因子P-2,可用逆相色层分析法加以进一步地纯化。细胞自杀因子P-2被浓缩成1毫升。加入一毫升含有0.05%三氟醋酸的甲醇。此法会造成大量蛋白质沉淀。然而,悬浮物仍然保有诱发细胞自杀的活性。之后,再将悬浮物置于逆相色层分析管RP-4中(迈可拉科学公司),并且利用由溶液A(水、0.05%三氟醋酸)和溶液B(甲醇、0.05%三氟醋酸)所组成的线性梯级加以进一步发展。线性梯级乃是在10分钟内,将0%至100%的溶液B加到溶液A中(20毫升的洗出体积,然后再以100%的溶液B洗清分析管五分钟)。第10图:利用阴离子交换色层分析法和逆相色层分析法所分离出的细胞自杀因子P-2被浓缩,并且透过4-20%等不同浓度的SDS-polyacrylamide胶质所造成的变性情况,暴露于电淋池中。胶质会被染上银色。如此会获得分子量65 KD的蛋白质色带。这项结果显示细胞自杀因子P-2被成功地分离,会在SDSPAGE上呈现分子量65 KD的图谱。第11图:利用阴离子交换色层分析法和逆相色层分析法所分离的细胞自杀因子L被浓缩,并且透过4-20%等不同浓度的SDS-polyacrylamide胶质所造成的变性情况,暴露于电泳池中。胶质会被染上银色。如此会获得分子量55 KD的蛋白质色带。第12图:细胞自杀因子L的阴离子交换色层分析法。利用DE52纤维素、和肝素琼质糖所分离的细胞自杀因子L,会被浓缩,并且置入Q2色层分析管中(BiO-Rad);Q2色层分析管乃是利由BiORad's BioLogic HPLC系统,藉由缓冲溶液A(10 mM TiS-HC1,酸硷値7.4)和缓冲溶液B(10 mMTiS-HC1,酸硷値7.4,0.55M氯化钠)构成之线性梯级所进一步发展而成。线性梯级乃是在10分钟内,渐次将0%至100%的缓冲溶液B加到缓冲溶液A中所构成。第7.8部份具有诱发HL-60细胞发生自杀效应的活性。第13图:细胞自杀因子L诱使HL-60细胞发生细胞自杀效应。利用DE52纤维素、肝素琼质糖和阴离子交换色层分析法所分离的细胞自杀因子L之活性,可利用以下的细胞系列加以测试:HL-60(血癌)和CCD 39 Lu(正常肺纤维母细胞)。为了呈现细胞自杀因子L在形态发育学上具有引发细胞自杀的活性,HL-60细胞会用以上述方法所分离出来的细胞自杀因子L培养15个小时,然后再以赫司特染剂染色2个小时。如第13(A)图所示,以控制组培养基培养的HL-60细胞之细胞核非常正常且健康(第13(A)图)。然而,以细胞自杀因子L培养的HL-60细胞之细胞核则呈现出细胞自杀的特征(第13(B)图)。首先,细胞自杀因子L会造成细胞核凝集,与控制组的细胞核(第13(A)图)比较,它会呈现出更强烈的萤光。再者,细胞核凝结也会并同去氧核糖核酸的断裂,细胞核的断裂如同第13(A)图所示。就如同我们稍早所曾提及的一般,细胞核凝集和去氧核糖核酸断裂,乃是细胞正値自杀阶段的二种型态特色。这些结果显示分离的细胞自杀因子L具有诱发HL-60细胞发生细胞自杀的活性。第14图:细胞自杀因子L诱使MCF-7细胞发生自杀现象。利用DE52纤维素、肝素琼质糖和阴离子交换色层分析法所分离的细胞自杀因子L之活性,可利用以下的细胞系列加以测试:MCF-7(乳癌细胞)。为了呈现细胞自杀因子L在形态发育学上具有引发细胞自杀的活性,MCF-7细胞会用上述方法所分离出来的细胞自杀因子L培养15个小时,如第14(A)图所示,以控制组培养基培养的MCF-7细胞之细胞核非常正常且健康(A)。然而,以细胞自杀因子L培养的MCF-7细胞之细胞核则呈现出细胞自杀的特征(第14(B)图)。这些结果显示分离的细胞自杀因子L具有诱发MCF-7细胞发生细胞自杀的活性。第15图:细胞自杀因子L不会让培养在英格氏培养基修正液-胰岛素-10%血清培养基中的正常乳细胞(Hs578 Bst)发生细胞自杀的情况。以控制组培养基或调理培养基调理HS 578 BSt细胞15个小时。细胞显得非常正常且健康;不管是否利用细胞自杀因子L来加以培养,Hs 578 Bst细胞的细胞核都维持一样。这些结果显示细胞自杀因子L不能诱使正常的乳房细胞(Hs 578 Bst)发生细胞自杀的情况。第16图:利用控制检体(PBS)培养LNCaP细胞,并不能诱使细胞自杀(第16(A)图)。利用胚胎质(Fetuin)(以25ug/ml的比例溶解于PBS中)培养LNCaP细胞,则会此现细胞自杀的迹象,其中包括细胞核凝集和去氧核糖核酸断裂(第16(B)图)。第17图:利用控制组缓冲溶液(PBS)培养HL-60细胞,并未能诱发细胞自杀效应。利用胚胎质(Fetuin)培养HL-60细胞,则会造成细胞自杀,这些细胞会展现出细胞核凝集和去氧核糖核酸断裂等现象(第17(B)图)。第18图:利用4.A.章节所述方法所配制而成、浓度为20ng/ml的胚胎质,则会诱发LNCaP,PC-3,HL-60,MCF-7,Colo 205和calul等肿瘤细胞发生细胞自杀效应,然而对正常的肺纤维母细胞(CCD 39 Lu)则不具有此种效应。第19图:使用胚胎质(25 mg/ml)培养15个小时的CCD 39 Lu细胞,在型态发育上仍然未见改变。第20图:浓度为25 mg/ml的胚胎质会诱使乳癌细胞(MCF-7)发生细胞自杀。 |
