主权项 |
1、一种根据部分DNA序列确定其两侧未知序列的方法,其特征在于通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切,选择合适的PCR引物,进行PCR扩展,其具体步骤如下:(1)寡聚脱氧核糖核酸引物设计:根据已知序列设计半巢式PCR引物,分别命名为P1和P2,长度为15-25bp,P2比P1更靠近待测的未知序列部分,而且两者可以部分的重叠,P2的3’端距离待测序列要保留15-100bp;合成引物LP,3’末端的四个寡聚脱氧核糖核苷酸为GTGC,长度为15-25bp,表述如5’-XXXGTGC-3’,其中的XXX表示根据基因组DNA的CG含量来设计的11-21bp长度的寡聚脱氧核糖核苷酸;再设计三种寡聚脱氧核糖核苷酸,分别命名为MBO,TAQ和MAE,序列为:MBO:5’-GATCGCAC-3’,TAQ:5’-CGGCAC-3’,MAE:5’-TAGCAC-3’(2)限制性内切酶的选择:根据对已知DNA序列上的限制性内切酶酶切位点的分析,选用在已知序列上没有酶切位点的常用酶,或者选择在从P1到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶,对基因组DNA进行酶切,并与三种寡聚脱氧焦糖核苷酸作用;经与寡聚核苷酸作用后,抽提基因组DNA,将基因组DNA用根据上述原则确定的限制性内切酶作用0.5-18小时后,纯化基因组DNA片断;(3)PCR模板构建:按照一定比例将寡聚脱氧核糖核苷酸MBO或TAQ或MAE与LP作用,使LP与相应的碱基配对部分形成双链,再与基因组DNA酶切后的产物在12-25℃用连接酶连接5-24小时;(4)PCR扩增:以步骤(3)中的产物为模板,以P1和LP为首轮PCR引物,PCR扩增待测的未知DNA序列;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收,再用LP和P2进行PCR扩增;对所得到的片段进行克隆和序列测定。 |