一种多杀菌素的发酵方法

摘要

本发明公开了一种多杀菌素的发酵方法，包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液接种到发酵培养基中，发酵；在发酵0‐12h时添加硬脂酸，在40‐56h时添加异丁醇，在90‐105h时添加甘氨酸，丙氨酸和缬氨酸，共发酵192‐216h。本发明的方法可使多杀菌素产量最高达到531.7mg/L。另外，这种培养方法所添加的物质成分单一，针对性更强，对于研究多杀菌素发酵过程的调控过程具有一定的指导意义。

主权项

一种多杀菌素的发酵方法，其特征是包括如下步骤：(1)将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；(2)将种子液以接种量10％‐15％的比例接种到发酵培养基中，于30℃、200‐250rpm发酵；在发酵0‐12h时添加硬脂酸，使终浓度为1.0‐2g/L，在40‐56h时添加异丁醇，使终浓度为1.8‐2.5g/L，在90‐105h时添加甘氨酸，使终浓度为0.3‐1g/L，添加丙氨酸，使终浓度为0.2‐0.8g/L,添加缬氨酸，使终浓度为0.1‐0.5g/L，共发酵192‐216h；所述基因工程菌LU104是将质粒pLU104通过结合转移从大肠杆菌S17‐1导入刺糖多胞菌ATCC49460，并同源重组整合到染色体中得到的；所述质粒pLU104是用下述方法制成：将包含SEQ ID NO.23所示的ermE*启动子的pIB139质粒用HindIII和XbaI酶切消化，得到0.3kb的包含ermE*启动子的HindIII/XbaI片段，插入质粒pOJ260，得到pOJ261质粒；用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物对spnK‑F‑Ndel和spnK‑R‑Xbal从刺糖多胞菌ATCC 49460染色体中获取spnK基因序列并扩增，再用Ndel和Xbal酶切消化，处理过的片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到重组pLU101质粒；用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对SN‑F‑XbaI和SN‑R‑XbaI从刺糖多胞菌ATCC 49460染色体中获取并扩增出：spnN，spnO，spnP，spnQ，spnR和spnS基因序列，PCR产物用XbaI酶切消化；酶切产物插入同样被XbaI酶切消化的质粒pLU101，得到重组质粒pLU102；gtt和gdh‑kre基因分别用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物对gtt‑F‑Ndel，gtt‑R‑Xbal和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的引物对gdh‑kre‑F‑Ndel，gdh‑kre‑R‑Xbal从刺糖多胞菌ATCC 49460染色体中获取并扩增，gtt基因的PCR产物用Ndel和Xbal酶切消化，处理过的PCR片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到pOJ263质粒；gdh‑kre的PCR产物酶切消化后插入pOJ261质粒中，得到pOJ262质粒；用SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25所示的引物对gtt‑F‑Xbal和gtt‑R‑MauBl，将ermE*启动子调控的gtt序列从pLU263质粒中扩增，并以Xbal和MauBl酶切消化，插入pOJ262得到质粒pLU103；pLU103质粒中的ermE*启动子调控的gtt和gdh‑kre序列用SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物对gdh‑gtt‑F‑MauBI和dh‑gtt‑R‑ManBl扩增，PCR产物用MauBl酶切消化，插入到pLU102质粒中得到质粒pLU104。