Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法

摘要

本发明提出一种Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法，所述Cyp基因敲除包括Cyp单基因敲除、Cyp多基因敲除。本发明方法中，首先利用CRISPR/Cas系统进行Cyp基因敲除大鼠的构建，包括敲除靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、假孕母鼠的准备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠繁殖，最后得到纯合子Cyp基因敲除大鼠。进一步，提取所述Cyp基因敲除大鼠肝脏，经匀浆、差速离心，得到Cyp基因缺失大鼠肝微粒体。本发明还提出了Cyp基因敲除大鼠及其肝微粒体在药物代谢研究中的应用。

主权项

一种Cyp基因敲除大鼠的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)利用CRISPR/Cas系统选择敲除靶点；所述靶点包括：如SEQ ID NO.1所示的Cyp2e1基因敲除靶点，AAGCAGATCTATAACAGT；或，如SEQ ID NO.2所示的Cyp3a1基因敲除靶点，CAAGAAACAGGGGATTCC；或，如SEQ ID NO.3所示的Cyp3a2基因敲除靶点，TAAGAAACAAGGAATTCC；2)体外sgRNA模板的合成与转录；所述sgRNA模板包含T7启动子序列和18bp靶点sgRNA序列，分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；3)胚胎显微注射；将sgRNA与Cas9mRNA共注射到受精卵胞浆中；4)培育靶点敲除大鼠；将由sgRNA与Cas9mRNA共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠与野生型大鼠交配，得到F1代大鼠；再经F1代大鼠杂合子相互交配，得到纯合子突变型大鼠,即所述Cyp基因敲除大鼠。