一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品

摘要

本发明公开了一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法及其产品。所述方法包括：a)收获病毒液；b)深层膜过滤、超滤、核酸酶解；c)强阴离子交换吸附床或吸附膜纯化；d)PEG沉淀、氯仿异戊醇抽提；e)灭活；f)蔗糖密度梯度离心纯化；g)超滤透析，除菌过滤；h)原液储备或乳化配制。本发明提供的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗抗原为均一完整的口蹄疫病毒颗粒，注入机体能够完全区别动物感染和免疫，不含口蹄疫病毒非结构蛋白和其他病毒颗粒，不含动物源性的外源蛋白、多肽、寡肽，有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应、致癌以及引起动物传染病如疯牛病的潜在风险，对动物食品安全和贸易没有影响。

主权项

一种大规模制备高产率、高纯度、高安全的口蹄疫全病毒颗粒标记疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：a)100000L生物反应器全悬浮培养BHK‑21细胞，细胞密度达到3‑5×10⁶/毫升时按照病毒感染复数MOI0.01‑0.1接种口蹄疫病毒细胞适应株，制备病毒原液，搅拌速度不超过40rpm，培养4天收获病毒液，使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时收获上清液和沉淀；沉淀在Triton‑X‑100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片，所述Triton‑X‑100的终浓度为0.1‑0.2％，反复冻融3次后超声3次，用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为≥10⁷logTCID₅₀/mL，总蛋白量为5‑7克，口蹄疫病毒146S含量为70‑85μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤25ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤100ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤100ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤5000pg/ml，Triton‑X‑100残余量≤6000μg/ml，内毒素≤150EU/毫升；b)膜深层过滤、超滤、核酸酶解：步骤a)得到的病毒上清液，依次经过0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜深层过滤和截留值为100,000‑300,000MWCO的膜包或中空纤维柱10倍超滤；高度特异、高活性的核酸酶按20‑50×10³单位/升加入到过滤后的上清液中，2‑8℃作用9‑18小时；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0‑10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为6‑6.5克，口蹄疫病毒146S含量为50‑60μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤7ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤30ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤90ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤4500pg/ml，Triton‑X‑100残余量≤510μg/ml，内毒素≤500EU/毫升；c)强阴离子交换吸附床或吸附膜纯化：经步骤b)酶解后的病毒上清液，经0.22μm膜过滤，然后通过强阴离子交换吸附膜或吸附床，进行分步洗脱；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0‑10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为2‑3克，口蹄疫病毒146S含量为30‑40μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤5ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤75ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤50ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤2500pg/ml，Triton‑X‑100残余量≤850μg/ml；d)PEG沉淀、氯仿异戊醇抽提：经步骤c)处理后的病毒上清液用PEG沉淀，缓冲液重悬沉淀，病毒重悬液经含抽提液抽提，所述抽提液是通过将三氯甲烷和异戊醇按24:1体积比混合后得到的；该步骤的质量控制指标为：口蹄疫病毒滴度为10^7.0‑10^8.0logTCID₅₀/mL，总蛋白量为3‑4.2克，口蹄疫病毒146S含量为50‑60μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤15ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤90ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤60ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤3500pg/ml，Triton‑X‑100残余量≤400μg/ml，PEG残余量≤250μg/ml，三氯甲烷残余量≤350μg/ml，内毒素≤55EU/毫升；e)灭活；0.025％二乙烯亚胺，4℃灭活48小时或37℃灭活2小时；f)蔗糖密度梯度离心纯化：步骤e)的灭活液通过连续流60％蔗糖等密度梯度超速离心纯化，该步骤质量控制指标为：总蛋白量2‑2.5克，口蹄疫病毒146S含量为20‑30μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤4ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤50ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤60ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤2000pg/ml，Triton‑X‑100残余量≤250μg/ml，PEG残余量≤200μg/ml，三氯甲烷残余量≤400μg/ml，内毒素≤800EU/毫升；g)超滤透析、除菌过滤：经步骤f)纯化后的病毒液经超滤透析并浓缩25‑50倍，病毒液经0.22μm膜除菌过滤，该步骤质量控制指标为：总蛋白量2‑2.5克，口蹄疫病毒146S含量为20‑30μg/ml，非结构蛋白3ABC残余量≤3ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤50ng/ml，BHK‑21细胞残余蛋白量≤30ng/ml，BHK‑21细胞残余DNA量≤100pg/ml，三氯甲烷残留量≤20μg/ml、PEG残余量≤10μg/ml、Triton X‑100残余量≤15μg/ml，内毒素≤35EU/毫升；h)原液储备或乳化配制。