分泌表达外源蛋白的酵母转化子及其制备方法

摘要

本发明公开了一种分泌表达外源蛋白的酵母转化子及其制备方法，所述方法步骤为：正向引物5’端引入XhoI，对应Kex2识别区域P1’位点分别引入20种氨基酸密码子，反向引物5’端引入NotI，得20对引物；以目标基因CDS序列cDNA或DNA为模板扩增，TA克隆得载体群P1’-CDS-pMD20-T；构建酵母真核表达载体群P1’-CDS-pPICZαA；转化载体群至酵母，筛选阳性转化子，并接到YPD平板，得相同拷贝数的转化子群甲醇诱导，分析蛋白产量，即得表达水平最高的转化子。本发明制备方法通过对Kex2的P1’氨基酸残基的优选以提高Kex2蛋白酶识别底物的活性，从而提高酵母分泌表达重组蛋白的产量。

主权项

一种分泌表达外源蛋白的酵母转化子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计克隆外源基因CDS的引物：正向引物的5’端引入XhoI位点，并在对应于Kex2蛋白酶识别区域的P1’位点分别引入20种天然氨基酸的密码子，反向引物的5’端引入NotI位点，得20对系列引物；所述P1’位点为Kex2剪切位点C‑末端方向的第一个氨基酸；(2)TA克隆感兴趣的外源基因CDS：以含有步骤(1)所述20对系列引物感兴趣的目标基因完整CDS序列的cDNA或者DNA为模板，用步骤(1)所述系列引物扩增出完整的CDS基因片段，回收PCR产物TA连接入TA克隆载体pMD20‑T，得到系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pMD20‑T，经过测序验证所有载体P1’位点氨基酸密码子与设计相同，且外源基因CDS确定为正确的可表达序列；(3)亚克隆构建酵母真核表达载体群：将步骤(2)所得的载体群P1’‑CDS‑pMD20‑T和酵母表达载体pPICZαA，分别经XhoI和NotI双酶切消化并回收，用Solution I连接试剂连接，得系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pPICZαA；(4)转化重组载体群至酵母宿主中：将步骤(3)所得的系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pPICZαA经SacI单酶切线性化后，回收酶切产物，再经氯化锂转化法转入毕赤酵母Pichia pastoris的X‑33宿主菌中，经zeocin90‑110μg/ml筛选得到阳性转化子；(5)确定酵母转化子拷贝数：将步骤(4)所得的阳性转化子转接到含zeocin浓度递增的YPD平板，所有能在同一zeocin浓度水平的YPD平板上生长而不能在下一更高浓度水平生长的酵母转化子视为具有相同外源基因整合拷贝数的酵母转化子，由此获得具有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’‑CDS；(6)酵母转化子的液体培养及甲醇诱导表达：将步骤(5)所得的有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’‑CDS及空载转化子接种至BMGY培养基，25‑30℃摇床培养至OD₆₀₀为1.8‑2.2，收集酵母细胞用BMMY培养基重悬，稀释至OD₆₀₀为0.9‑1.1，甲醇诱导110‑130h，离心并收集上清；(7)筛选表达水平最高的重组载体转化子：通过分析步骤(6)所得的上清中外源重组蛋白产量，筛选分泌表达量最高的特定P1’氨基酸的重组载体转化子须在拷贝数相同的各P1’变化系列载体转化子P1’‑CDS之间进行比较，即得表达水平最高的P1’氨基酸的重组载体转化子；步骤(1)所述20种天然氨基酸的密码子的正向引物分别为：SEQ ID NO.1：Glu：5’‑CTCGAGAAAAGAGAA‑CDS‑3’；SEQ ID NO.2：Ala：5’‑CTCGAGAAAAGAGCT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.3：Arg：5’‑CTCGAGAAAAGAAGA‑CDS‑3’；SEQ ID NO.4：Asn：5’‑CTCGAGAAAAGAAAC‑CDS‑3’；SEQ ID NO.5：Asp：5’‑CTCGAGAAAAGAGAT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.6：Cys：5’‑CTCGAGAAAAGATGT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.7：Gln：5’‑CTCGAGAAAAGACAA‑CDS‑3’；SEQ ID NO.8：Gly：5’‑CTCGAGAAAAGAGGT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.9：His：5’‑CTCGAGAAAAGACAT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.10：Ile：5’‑CTCGAGAAAAGAATT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.11：Leu：5’‑CTCGAGAAAAGACTT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.12：Lys：5’‑CTCGAGAAAAGAAAA‑CDS‑3’；SEQ ID NO.13：Met：5’‑CTCGAGAAAAGAATG‑CDS‑3’；SEQ ID NO.14：Phe：5’‑CTCGAGAAAAGATTT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.15：Pro：5’‑CTCGAGAAAAGACCA‑CDS‑3’；SEQ ID NO.16：Ser：5’‑CTCGAGAAAAGATCT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.17：Thr：5’‑CTCGAGAAAAGAACT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.18：Trp：5’‑CTCGAGAAAAGATGG‑CDS‑3’；SEQ ID NO.19：Tyr：5’‑CTCGAGAAAAGATAT‑CDS‑3’；SEQ ID NO.20：Val：5’‑CTCGAGAAAAGAGTT‑CDS‑3’。