一种使用辣根过氧化物酶标抗体检测猪瘟弱毒病毒滴度的方法

摘要

一种采用辣根过氧化物酶免疫技术检测猪瘟病毒弱毒滴度的方法，其特点是将传代贴壁细胞MPK细胞接种到96孔培养板中，用适宜的生长培养基维持其生长，MPK细胞在96孔板中快速增殖，当细胞长为单层后接种猪瘟病毒，并继续培养令病毒增殖，若干天后加入辣根过氧化物酶标抗体和底物，经过孵育使细胞培养物显色。本发明采用辣根过氧化物酶免疫技术，可在MPK细胞中标记出病毒的存在，使用PEG增加病毒与细胞的聚合度从而促进其感染，其灵敏度高于药典规定的动物实验测定病毒滴度的方法，可以作为企业质量内控的方法。

主权项

一种采用辣根过氧化物酶免疫技术检测猪瘟病毒弱毒滴度的方法，其特征在于挑选出对猪瘟弱毒株高度敏感的MPK传代细胞, 将此细胞在96孔培养板中培养至长满单层,之后接种不同稀释度的猪瘟病毒，持续培养后，加入辣根过氧化物酶标记的抗体共同孵育，最后加入底物使受到感染的细胞培养物显色，通过显色的孔数占总孔数的百分比计算病毒滴度，具体步骤为：(1) 使MPK细胞在96孔培养板中长成单层；(2) 将待测病毒液进行梯度稀释，接种于细胞单层，用维持培养基维持细胞生长；(3) 持续培养72～120小时后，将细胞培养物热固定，加入辣根过氧化物酶标抗体在37℃下孵育，再加入底物于常温下孵育；(4) 在显微镜下观察细胞培养物的显色情况，根据显色孔数的百分比计算病毒的滴度；所述步骤（1）中使用的细胞生长培养基是经过优化的，适合MPK细胞生长的培养基，其中每升液体培养基含有5～8克gibco公司生产的高糖DMEM， 3.5～5.5克gibco公司生产的M199， 1.5～3克上海沪试化工有限公司生产的NaHCO₃，50～120毫升太原润生生物材料有限公司生产的牛血清，培养基的pH为7.2～7.4；所述步骤（2）中细胞培养基为经优化的维持培养基，其中每升液体培养基含有5～8克gibco公司生产的高糖DMEM， 3.5～5.5克gibco公司生产的M199， 1.5～3克上海沪试化工有限公司生产的NaHCO₃，10～40毫升太原润生生物材料有限公司生产的牛血清，培养基的pH为7.2～7.4；所述MPK细胞在96孔培养板内生长时的温度为36.5～37.5℃，培养时的pH为7.0～7.5，CO₂浓度为2%～4%，接种病毒前培养时间为96～144小时，接种病毒后培养时间为72～120小时；所述步骤（2）中接种病毒时使用Sigma公司生产的分子量为600～1500的聚乙二醇来提高病毒对细胞的感染率，聚乙二醇浓度为1%～4%。