感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法

摘要

本发明属于细胞冻存复苏技术领域，特别涉及一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法。本发明通过将感染家蚕微孢子虫的家蚕细胞和孢子密封后于4℃放置1h，然后转至-20℃放置3h，并转至-80℃放置过夜后保存于液氮中；最后将感染细胞和孢子解冻后直接加入培养瓶中或者将感染细胞和孢子解冻并进行差速离心后将感染细胞和孢子加入培养瓶中进行复苏培养，得到复苏的微孢子虫及感染微孢子虫的细胞，建立了稳定的家蚕微孢子虫体外增殖培养体系，能够获得大量且能够稳定地进行培养的感染细胞。

主权项

一种感染家蚕微孢子虫的家蚕胚胎细胞冻存复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将感染且分裂正常的细胞收集于离心管中进行差速离心，于1000r/min离心3min收集感染细胞，然后于4000r/min离心5min收集孢子，除去离心管内残余的培养基后，加入1mL冻存液重悬感染细胞和孢子；(2)将步骤(1)中重悬的感染细胞和孢子同时转移至冻存管中，密封并标识后于4℃放置1h，然后转至‑20℃放置3h，最后转至‑80℃放置过夜后保存于液氮中；(3)将步骤(2)中冻存的感染细胞和孢子解冻后加入培养瓶中，贴壁培养0.75‑1h后，收集培养液，更换培养基，将收集的培养液进行差速离心，1000r/min离心5min收集上清液，将收集的上清液经4000r/min离心5min，取沉淀，加入100μL培养基重悬后添加回培养瓶，培养48h后再次更换培养基，培养48h，得到复苏的微孢子虫和感染微孢子虫的细胞；所述的细胞为家蚕胚胎细胞；所述的孢子为家蚕微孢子虫孢子；所述的微孢子虫为家蚕微孢子虫。