草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法

摘要

本发明涉及草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；洗涤酶标板以及对底物显色；对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。本发明的有益效果是：为检测草鱼中肿瘤坏死因子alpha的蛋白表达水平提供了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。

主权项

草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤：步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；具体操作过程为用pH为9.6且浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液抗原稀释液稀释每孔浓度为2μg/ml的草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白成为包被液，用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100μl；4℃条件下包被过夜后甩干，用pH为7.4、浓度为0.1M且含0.05％Tween‑20的磷酸盐缓冲液即PBST洗涤液洗涤三次，每次300μl/孔，每次3分钟；步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；具体操作过程为用由pH为7.4且浓度为0.1M的PBS稀释5％脱脂奶粉和0.3％牛血清白蛋白溶液组成的封闭液室温封闭2小时，每孔加封闭液300μl；步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液；具体操作过程为用PBST抗原/抗体稀释液将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml以及20ng/ml作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50μl与PBST溶液中按1：2000比例稀释得到的50μl酶标抗体混匀后室温孵育2小时；对待测样品的检测：取待测样品50μl与50μl 1:2000稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时；步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；具体操作过程为酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300μl PBST洗涤三次，每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100μl，室温孵育至少2小时；步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色；具体操作过程为待步骤24结束后，甩干孔内液体，用300μl PBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入100μl TMB底物，37℃反应20分钟后加入50μl 2M硫酸H₂SO₄终止反应；步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值OD，根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。