抗人源肠毒素大肠杆菌粘附素蛋白的卵黄抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因etpA与鞭毛基因fliC的重组质粒pET-EF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用基因工程技术构建了重组质粒pET-EF，将上述重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pET-EF表达融合蛋白EF。利用表达的重组蛋白主动免疫初产蛋鸡，制备了针对这种蛋白的卵黄抗体，提取的IgY验证了重组蛋白具有良好的抗原性，检测了在不同pH、温度及酶的条件下的稳定性，并利用小鼠肠道攻毒试验，证明提纯的IgY能够抑制ETEC菌株在体外对上皮细胞的粘附。

主权项

一种用于治疗人源肠毒素大肠杆菌腹泻的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)以人源肠毒素大肠杆菌标准株H10407的DNA为材料，设计引物，PCR扩增目的片段，将扩增后的目的片段连接至表达载体，构建含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因etpA与鞭毛基因fliC融合基因的重组质粒pET28a‑EF，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PCR扩增引物为：2)将重组质粒pET28a‑EF转化入大肠杆菌BL21(DE3)，以诱导物IPTG诱导表达，最佳诱导表达条件为：37℃摇床培养至OD600达到0.5‑1.0，加入诱导物至浓度为0.5mM，继续培养3‑4h，收集菌体，获得表达所述重组质粒pET28a‑EF的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET‑EF；3)从重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET‑EF中分离纯化融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；4)向复性、浓缩后的融合蛋白溶液中加入灭菌的tween‑80至终浓度4％，再与等体积白油佐剂在组织匀浆机中混合30min，充分乳化至蛋白浓度为0.5mg/mL，对蛋鸡进行免疫，采用胸部肌肉注射，首免2周后加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周随机采集鸡蛋ELISA监测抗体效价变化，待卵黄抗体效价达1:2⁹后收集鸡蛋，从鸡蛋中提纯收集卵黄抗体。