一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法

摘要

本发明公开了一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，用于产NetB毒素产气荚膜梭菌感染的早期检测，为产气荚膜梭菌病的特异性诊断和综合防治及后续科学研究提供有效的检测工具。所述阻断ELISA方法包括以下两个步骤：一、阻断ELISA检测方法的建立；二、结果判定标准的确定。本发明建立了一种快速、敏感和特异的阻断ELISA方法来检测产气荚膜梭菌感染血清中NetB毒素的特异性抗体，有望成为临床产气荚膜梭菌病快速诊断和免疫检测的重要工具，必将在产气荚膜梭菌病的诊断和防治中发挥重要作用，具有很好的应用价值。

主权项

一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，其特征在于所述检测方法步骤如下：一、阻断ELISA检测方法的建立(1)用包被液将产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白稀释至5μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；(2)PBST溶液洗涤3次，加入封闭液200μL/孔，37℃孵育2h；(3)PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，同时设置阴性和阳性对照，阳性对照为NetB毒素多克隆抗体，阴性对照为阴性血清，100μL/孔，37℃孵育1.5h；(4)3次PBST溶液洗涤后，将抗产气荚膜梭菌NetB毒素的F9G3单克隆抗体用PBS缓冲液稀释至0.635μg/mL，100μL/孔，37℃反应1h；(5)PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液1∶5000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次；(6)最后加入显色液100μL/孔，室温条件避光反应10min，用2M H₂SO₄溶液终止反应，490_nm处读取吸光值；二、结果判定标准的确定计算CP阴性样品平均值与标准差(S)，求得为阳性临界值，为阴性临界值；当样品阻断率则血清样品判为阳性；当时为阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测一次，如仍可疑则判定为阳性。