一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法

摘要

本发明涉及动物生殖和分子生物学操作技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。公开了一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法。为了提高牛核移植效率中的供体细胞的数量，本发明利用活体采样，接种法培养细胞，稳定传代的活力为OD值为0.609±0.053的第六代细胞，用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理细胞24h后的细胞作为供体细胞，为重构胚更好的发育奠定了基础。

主权项

一种筛选牛核移植供体细胞的方法，其特征在于以下步骤：A、供体细胞的培养1)采样：用75％的酒精擦洗牛耳尖端4‑5cm²的组织，用眼科剪刀剪取组织，用75％的酒精冲洗组织三遍，再用含有双抗的磷酸盐缓冲液PBS冲洗三遍，放入细胞培养液‑1中，得到牛耳组织样品；2)利用接种法培养牛耳成纤维细胞：将上步所得的牛耳组织样品分别用75％酒精和1％双抗的PBS冲洗三次，置玻璃皿中，剔除毛发和表皮，用眼科剪剥取其真皮组织，用含1％双抗的PBS充分冲洗后剪至1mm³的小组织块，置于细胞培养液‑1中，于800r/min下离心3min，反复洗涤6‑8次，加入少量细胞培养液‑2，将离心洗涤后的组织块均匀铺于培养皿底部，吸出多余培养液，置于37.5℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中孵育；孵育时间为8‑12h；再加入细胞培养液‑22.5‑3ml，每隔两天更换细胞培养液‑2一次；3)观察培养皿中组织块边缘是否有细胞长出，当细胞长满皿底95％以上时，剔除组织块；用胰蛋白酶消化上步所得细胞3‑5min，观察细胞是否变圆，并漂浮于培养液中，加入细胞培养液‑1终止消化，在1200r/min下离心5min，重复离心两次，将一个培养皿的细胞转移至两个新的培养皿中；4)在细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力，即MTT‑OD值测定，收集对数期生长的细胞，调整细胞悬液浓度为5.0×10⁴个/ml，每孔加入100ul，使待测细胞调密度为5000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充；在5％CO₂，37.5℃孵育，至细胞单层铺满96孔平底板的孔底，每孔加入20μlMTT溶液，继续培养4h，终止培养；小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，选MTT‑OD值为0.609±0.053的第六代细胞；5)将上步所得的第六代细胞分别用含有0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L的β‑巯基乙醇的细胞培养液培养24小时，然后测定细胞的MTT‑OD值和抗氧化指标；选择细胞活力和抗氧化力最强的100μmol/L的β‑巯基乙醇处理24h的细胞使用含有0.5％胎牛血清的DMEM饥饿处理，同时将第六代细胞做同样的饥饿处理，均作为供体细胞，备用；B、受体细胞的制备卵母细胞的制备：将牛离体卵巢迅速放入37℃的PBS中，用75％的酒精泡1min，再用含有双抗PBS冲洗3～4次，用带有12#针头的10ml一次性注射器从大小为2‑8mm卵泡中吸取卵丘卵母细胞复合物放入成熟培养微滴中进行成熟培养，每100μl成熟培养微滴中含20‑25个卵母细胞，培养皿放入38.5℃、5％CO₂和相对饱和湿度条件的培养箱中培养22‑24h至成熟，备用；C、核移植1)核移植：将体外成熟培养的卵丘卵母细胞复合体即COCs转入含0.1％浓度的透明质酸酶的成熟培养液中消化5分钟，再用移液枪反复吹打，之后用成熟培养液即OMM洗2‑3次，尽量去掉卵丘细胞，随后放在体视显微镜下挑选包含第一极体的卵母细胞作为受体，之后将其放入含5μg/ml的细胞松弛素的新鲜配制的OMM的操作液微滴中，其上覆盖矿物油平衡10‑15min，在显微操作仪下，用去核针去除第一极体及附近的胞质，放在5μg/ml Hoechst 33342染色液中检测去核效果，将去核完全的受体卵母细胞的卵周隙内用注核针吸入边缘光滑、胞质均匀的供体细胞，得到重组胚；将所得重组胚转移至成熟培养液中修复2‑3h；2)将修复后的重组胚在含5μmol/L离子霉素的成熟培养液中培养5min，再用培养液洗2‑3遍，然后将其放入含2mmol/L 6‑二甲氨基吡啶的胚胎培养液中孵育4h，再冲洗2‑3次之后，第二组和第三组转移到含β‑巯基乙醇100μmol/L的胚胎培养液微滴中，第一组转移到不含β‑巯基乙醇的胚胎培养液微滴中，置38.5℃、5％CO₂和相对饱和湿度条件的培养箱中，每48h换一次液，72h后加入10％胎牛血清继续培养，观察并记录胚胎发育情况；其中：细胞培养液‑1配制：胎牛血清10ml，1ml青霉素‑链霉素抗菌液，即双抗，用杜贝柯氏最小必需培养液即DMEM定容至100ml；细胞培养液‑2配制：胎牛血清20ml，1ml青霉素‑链霉素抗菌液，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml；磷酸盐缓冲液PBS配制：NaCl 8.00g/L、KCl 0.20g/L、KH₂PO₄0.20g/L、NA₂HPO₄1.15g/L，用超纯水溶解，灭菌后常温保存；OMM成熟培养液配制：TCM19926ml、胎牛血清3.0ml、促卵泡激素15μg、促黄体素150ng、雌二醇30μg、表皮生长因子150ng、丙酮酸钠6.6mg、青霉素‑链霉素抗菌液0.3ml；过滤灭菌，4℃下保存；胚胎培养液配制：肌醇0.015g、必需氨基酸900μl、非必需氨基酸300μl、牛血清白蛋白0.09g、青霉素‑链霉素抗菌液300μl、丙酮酸盐600μl、Stock G 30μl、Stock C 28ml；过滤灭菌，4℃下保存；各种盐溶液的配制：Stock A：NaCl1.267g；KC l0.107g；KH₂PO₄0.032g；MgSO₄·7H₂O 0.036g；青霉素‑链霉素抗菌液0.2ml；Na‑Lactate 0.12ml；H₂O 19.5ml；Stock B：NaHCO₃0.21g_；H₂O 10ml；Stock D：CaCl₂·2H₂O0.262g；H₂O10ml；Stock G：L‑Glucose 0.292g；H₂O 10ml；Stock C：STOCK A1.1ml；STOCK B 1.0ml；STOCK D 0.1ml；H₂O 7.9ml。