检测重金属胁迫下核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法

摘要

本发明公开了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法。它是切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干，放在1％TritonX-100浸泡15分钟；然后滴入15μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，处理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后在荧光显微镜下观察。本发明的检测方法具有特异性高、实验结果准确，大大提高了观察细胞数目等特点。该方法为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其检测方法具有广阔的应用前景。

主权项

一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁C23蛋白质定位的免疫荧光方法，其特征在于，按如下的步骤进行：(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1‑2h；经PBS缓冲液洗；(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解，在酶解过程中随时镜检，直到有大量的球形原生质体产生结束酶解，经PBS缓冲液洗涤后压片；(3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取0.1‑0.2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX‑100浸泡15‑20分钟；经PBS缓冲液洗涤；(5)在(4)得到的载片上滴入15‑20μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h‑1.5h；再经PBS缓冲液洗涤；所述的一抗为：鼠抗C23单克隆抗体，其浓度为0.2mg／ml；(6)再将(5)得到的载片上滴入15‑20μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min‑1h；经PBS缓冲液洗涤；所述的二抗为：TRITC‑山羊抗鼠IgG其浓度为1.5mg／ml；(7)再将(6)的载玻片上滴加15‑20μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5‑10μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1‑2h后在荧光显微镜下观察；其中DAPI的浓度为1μg／ml。