猪外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

摘要

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，涉及猪外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。通过采集猪外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA；采用普通PCR扩增PD-1目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；将PD-1目的基因片段与pMD18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，按拷贝浓度绘制成标准曲线；根据荧光信号变化及标准曲线测出PD-1的基因丰度。本发明的猪PD-1基因丰度实时检测方法具有检测通量高、敏感性高、特异性强、操作简便、成本低及定量准确等优点。

主权项

猪外周血单核淋巴细胞PD‑1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：采集仔猪的外周血，分离出外周血单核淋巴细胞，提取外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于‑20℃，采用普通PCR方法扩增PD‑1目的基因片段；采用普通PCR方法扩增PD‑1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD‑1目的基因纯化片段与pMD 18‑T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20µmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水；其中，正向引物F为：5′‑ GTGGGAGGCTGCCTTGGA ‑3′反向引物R为：5′‑GGAGGGGAGTGCAGAGGTG ‑3′。