| 摘要 |
1. Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР-1) человека, включающий: выделение РНК из образцов анализируемого материала (кровь, ткани, коскобы, пунктаты, клеточные культуры), синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, амплификацию кДНК генов с помошью ПЦР в реальном времени, отличающийся тем, что:а) нормирование полученных результатов выполняют при помощи нормировочного коэффициента, рассчитанного как среднее арифметическое количества в образце кДНК генов RPL32, АСТВ и PII кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно, при этом амплификацию кДНК генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи одной triplex-ПЦР;б) накопление продуктов амплификации детектируют в режиме реального времени при помощи одного из способов:1б) при помощи интекалирующего с двухцепочечной ДНК флуоресцентного красителя с высоким индексом дискриминации флуоресценции у связанной и несвязанной форм, например, SYBR GreenI (Invitrogen);2б) при помощи олигонуклеотидной пробы типа TaqMan комплементарной центральной части амплифицируемого фрагмента транскрипта; проба длиной 20-30 нуклеотидов, несет на 5'-конце флуорофор (FAM, R6G, ROX) и на 3'-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.);в) определение относительного количества кДНК гена МСР1 и нормировочных генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи калибровочной кривой построенной при амплификации стандартных образцов ДНК взятых в 6-ти последовательно убывающих трехкратных разведений известных концентраций; стандарт представляет собой смесь фрагментов ДНК, несущих амплифицируемую последовательность кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 длиной по 500 пар нуклеотидов; о� |
