基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法

摘要

本发明涉及一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，属于药理学技术领域。包括以下四步：（1）将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入pCDNA3等表达质粒载体，并进行载体鉴定和蛋白表达检测；（2）将携带目的基因的pCDNA3等重组质粒转染入293T等细胞，进行重组蛋白的表达；（3）将得到表达标签蛋白的细胞进行CETSA检测；（4）在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上，对多种药物、多种靶标蛋白的高通量分析；得到的CETSA数据用于分析。本发明技术能够高效灵敏快速地进行高通量检测，可用于化合物的体内蛋白靶点的筛选。

主权项

一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，其特征在于：包括以下四步：人类全基因组带标签的表达质粒的构建、带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取、CETSA检测、高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析，具体如下：（1）人类全基因组带标签的表达质粒的构建：将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入Flag‑pCDNA3等表达质粒载体，并进行带标签质粒鉴定和标签蛋白表达的检测；以HeLa细胞全基因组转录组RNA为模板，PCR法扩增出目的基因，利用ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将目的片段连接到flag‑pCDNA3等表达载体上；再将构建成功的pCDNA3等表达重组质粒和内参质粒β‑gal瞬时共转染入细胞，培养48 h后检测荧光素酶活性；（2）带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取：实验前1天按照100万个293T或其他细胞铺细胞于10厘米细胞培养皿；18小时后将携带目的基因的阳性pCDNA3等表达重组质粒转染入293T细胞，进行重组蛋白的表达，具体过程为：10厘米细胞培养皿中，每10ug目的质粒；细胞37°C培养于10% 胎牛血清 + DMEM细胞培养基中，孵育48小时后，胰酶法收集细胞，同时加入蛋白酶抑制混合物（Protease Inhibitor Mixture Set III），EDTA和2000活力单位的核酸酶；细胞裂解物提取过程为：将得到的细胞按照100万细胞每毫升PBS比例稀释，vertex混匀，放置液氮10分钟，常温溶解10分钟，如此反复冻融3次；4℃，2000g离心20分钟取上清；（3） CETSA检测：将得到表达标签蛋白的细胞裂解液进行CETSA检测；步骤（2）中获取的细胞裂解液，一部分加入适宜浓度的待测药物，另一部分加入抑制剂，室温孵育10～30分钟后，将细胞悬液等分成50μl，分别在不同温度下加热3‑10分钟；然后将细胞提取物再次20000g，4°C离心20分钟，分离得到的上清液，弃去不溶性沉淀；然后取10μl样品进行酶联免疫吸附测定（enzyme‑linked immune sorbent assay，ELISA）；ELISA实验最终得到各药物‑蛋白孵育作用后的吸光度值；该吸光度值与CETSA最低的药物‑蛋白孵育温度直接相关，据此绘制CETSA曲线和ITDRFCETSA（等温量效反应指纹图谱）；（4）高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析：在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上，对多种药物、多种靶标蛋白的高通量分析；得到的CETSA数据（ELISA得到的吸光度值）用于分析；CETSA数据和相应的ITDRFCETSA数据进行s形（可变斜率）曲线拟合；或者计算药物对蛋白的半数抑制浓度（IC50），通过Lineweaver Burk曲线得到药物对蛋白的抑制常数Ki。