CryIAc蛋白标准物质定值的方法

摘要

本发明提供一种CryIAc蛋白标准物质定值的方法，BT晶体蛋白具有高特异的杀虫活性，是近年来应用最为广泛的生物杀虫剂。在实际检测工作中，经常需要对待检测转基因作物进行CryIAc蛋白定性和定量检测，但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种CryIAc蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和追溯性。

主权项

一种CryIAc蛋白标准物质定值的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成两条特异性肽段：LIGNYTDYAVR、IVAQLGQGVYR用于进行CryIAc蛋白定量；(2)同时使用全氘标记的亮氨基合成对应的两条同位素标记肽段；(3)以亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对合成的两条标准肽段进行准确定量；(4)按400μL溶液中所含CryIAc蛋白质量，根据两条肽段的纯度计算酶切后所得两条目标肽段的质量，配制相应浓度标准肽段及同位素内标肽段；(5)准确称量400μL CryIAc蛋白溶液，加入并称量相应体积的同位素内标溶液；使酶切后所得目标肽段与内标肽段摩尔比为1∶1；(6)离心干燥上述已加入内标的蛋白溶液，加入100μL的8M尿素溶液对蛋白进行变性处理；10min后加入2μL1M的二硫苏糖醇溶液在60摄氏度水浴中加热60min；然后加入2μL1M的碘乙酰胺，在暗处反应40min；加入6μL1M的二硫苏糖醇还原多余的碘乙酰胺；用100mM的碳酸氢胺溶液稀释尿素至1M以下，加入2μL0.5mg/mL的胰蛋白酶溶液进行酶切；酶切84小时后采用同位素稀释质谱法对两条肽段进行准确定量；(7)根据质谱所得酶切后肽段与同位素肽段的比例配制标准肽段与内标肽段比例的标准曲线；计算溶液中肽段含量，根据蛋白的分子量计算每400μL溶液中CryIAc蛋白的浓度作为标准物质的定值结果；其中CryIAc标准物质制备过程：(1)配制浓度为0.1％的氨水溶液，用于溶解经过纯化的CryIAc；(2)配制浓度为50μg/g CryIAc溶液；(3)将CryIAc溶液分装至500μL冻存管中，每只冻存管中分装400μL溶液，分装好的标准物质在－80摄氏度冰箱中冷冻保存。