乙酰胆碱酯酶的固定化方法和应用

摘要

一种用Ni-NTA树脂制备固定化重组乙酰胆碱酯酶的方法，即将由基因工程技术制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液与经缓冲液处理的Ni-NTA树脂混合后，离心处理制得固定化乙酰胆碱酯酶。在使用基因工程技术制备重组乙酰胆碱酯酶过程中，限制性内切酶、转移质粒载体、感受态细胞、宿主的合理选择与配合可进一步影响固定化乙酰胆碱酯酶的制备。Ni-NTA树脂与酶液的用量，离心速度和时间，对固定化乙酰胆碱酯酶的制备效果也有进一步的影响。通过本法制得的固定化重组乙酰胆碱酯酶活性高、稳定性好、易于保存，并可直接且有效地用于底物检测、抑制剂筛选和农药残留检测。本法流程短，操作简单，节省了大量人力物力，适合于工业应用。

主权项

一种制备重组乙酰胆碱酯酶固定化载体的方法，特征在于：采用如下步骤制备：A．原料准备采用基因工程技术获得带有组氨酸标签的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液； 用缓冲液洗涤Ni‑NTA树脂三遍，以3000rpm转速离心30秒钟，弃上清；所述的基因工程技术包括目的基因的分离和制备、重组体DNA的制备、外源重组DNA片段导入宿主细胞等步骤；所述宿主是毕赤酵母Pichia pastoris KM71；所述步骤A中缓冲液的配方是300 mM NaCl，50 mM Na3PO4，10 mM 咪唑，pH 7.4；所述缓冲液用量是Ni‑NTA树脂体积的5倍；B．将步骤A中制得的重组乙酰胆碱酯酶粗酶液和处理后的Ni‑NTA树脂按3：1的体积比混合，离心处理；重组乙酰胆碱酯酶粗酶液的总蛋白含量为500 mg•mL‑1以上。