一种组织工程角膜的制备方法

摘要

一种组织工程角膜的制备方法，本发明采用表皮干细胞和多能基质干细胞为种子细胞，经体外扩增培养后种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜；本发明所用支架既克服了异种角膜基质免疫排斥大的难题，又保留了天然角膜的结构(能够恢复角膜的透明度)和主要成分(包括能促进角膜细胞生长、增殖和分化的生长因子)；与现有技术产品相比，本发明具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点；其含有活细胞的组织工程角膜有一定的弹性和韧性，形状大小和厚度易于改变，免疫原性极低；能避免非角膜材料引起的并发症，植入体内可被受体细胞所改建，能迅速与机体整合实现透明，适用于修复各种原因导致的角膜损伤。

主权项

一种组织工程角膜的制备方法，包括有多能基质干细胞和表皮干细胞的获得，其特征在于：是采用多能基质干细胞和表皮干细胞作为种子细胞，经体外扩增培养后将其种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜；所述的多能基质干细胞和表皮干细胞来自皮肤或粘膜，经分离、扩增和体外诱导分化，使多能基质干细胞转化为角膜基质细胞，表皮干细胞转化为角膜上皮细胞；所述的脱细胞天然角膜基质来自动物角膜，经削切、脱细胞、脱水处理后所形成的板层角膜支架；所述的体外诱导培养是采用诱导培养液诱导种子细胞分化培养的过程；具体步骤包括：步骤一、制备角膜支架：取动物角膜剥离去掉角膜周围组织，PBS溶液清洗后置于‑80℃中冷冻至少30分钟，于室温下解冻，如此反复冻融2～5次；再于4℃纯水中浸泡，溶胀后削切至所需厚度；再将其置于蛋白酶溶液中消化，用纯水漂洗干净；再置入0.1～1M的NaOH溶液中浸泡8分钟以上，用PBS溶液漂洗至pH中性；将其置入含有DNA酶和α‑半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，用PBS溶液漂洗；经脱水干燥后，使用含牛血清、或胶原蛋白、或多聚赖氨酸、或精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸的任一种溶液浸泡20分钟以上，经脱水干燥后消毒，得到角膜支架；步骤二、种子细胞的培养：取新鲜皮肤或粘膜，分离培养获得多能基质干细胞和表皮干细胞；步骤三、配制诱导培养液：其组成是在商用EpiLife培养液中添加有，碱性成纤维细胞生长因子2～20ng/ml、表皮细胞生长因子2～20ng/ml、转化生长因子‑1为2～30ng/ml、胰岛素2～40ng/ml、氢化可的松50～400 ng/ml、腺嘌呤20～40μg/ml、转铁蛋白1～10μg/ml、前列腺素‑E2为0.5～8ng/ml、胰岛素样生长因子‑1为2～10ng/ml；步骤四、制备组织工程角膜：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10份∶透明质酸2～3份∶硫酸软骨素0.5～1份混合，用0.1～0.5M的醋酸溶液将其配制成浓度为2～10mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入终浓度为10mg/ml的DMEM培养基，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液；再将所制备角膜支架的基质面浸透凝胶溶液，置于37℃环境下预固化；将体外培养的多能基质干细胞混合于凝胶溶液中，按105～106个/cm2的细胞密度滴加到预固化角膜支架上，静置固化后翻转角膜支架，将体外培养的表皮干细胞按104～105个/cm2的细胞密度滴加到角膜支架另一面，静置2～3小时后，置于培养器皿内的培养支架上，采用诱导培养液连续培养6～10天，培养期间每天换液，组织工程角膜培养完成。