一种快速检测啤酒中有害菌的方法

摘要

本发明公开了一种应用荧光原位杂交和荧光微菌落结合的技术为啤酒厂快速定性及定量检测有害菌的方法。包括样液及培养基的制备、荧光微菌落及荧光原位杂交试验操作。而后用荧光显微镜观察并计数，根据荧光探针与CFDA染料所被激发的不同颜色的荧光来定性及定量分析啤酒厂生产过程中所带来的有害菌。本发明还公布了两个特异探针，分别是用于短乳杆菌检测的探针：5’-TAGCCGGTGTAACCCTGACTCTG-3’，一端用Cy3标记；四联球菌检测探针：5’-GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAA-3’，其一端用Cy3标记。本发明通过把两种方法相结合，避免了荧光原位杂交不容易定量，实验结果易出现假阳性及假阴性的现象；同时也很好的解决了荧光微菌落技术不能定性的问题。达到了啤酒厂生产所需要的快速检测，并且定性及定量的要求。

主权项

一种快速检测啤酒有害菌的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)快速增菌培养基的制备取快速增菌培养基粉末，该粉末组成如下：蛋白胨5～8g，酵母膏4～6g，牛肉膏6～10g，吐温80 0.5～1g，磷酸氢二钾1～2g，醋酸钠3～6g，叶酸0.1～0.2g，放线菌酮6～10mg，琼脂10～15g，葡萄糖10～15g，麦芽根浸粉0.1～0.5g，泛酸钙0.2～0.5g，溶于蒸馏水中，121℃灭菌15分钟，倒平板，该培养基能让有害菌快速增长，加快检测时间；(2)微菌落荧光染色取样液300‑500mL，将经过高温灭菌的聚碳酸酯膜放至抽滤系统进行抽滤，取出滤膜放在快速增菌培养基上28℃厌氧培养30小时，然后将滤膜取下，避光进行CDFA染料染色，染色后清洗滤膜，洗掉染色液，以去除背景影响；(3)荧光原位杂交试验将进行过CFDA染色的膜片直接进行荧光原位杂交实验，将膜片进行蛋白酶K处理，取出膜片，浸入含有溶菌酶的磷酸缓冲液中处理，取出后，放入有乙醇的染色缸中，分别在质量分数为50％，80％，100％乙醇中脱水，每一浓度浸泡3min，添加浓度为50ng/μL的10μL体积探针溶液和90μL杂交缓冲液到微量离心管中，冰浴中避光保存，杂交箱里放吸水纸，用杂交液湿润，添加20μL的杂交混合液、10μL的blocking regent到膜片上与样品混合，将膜片放入杂交箱里，恒温箱中进行杂交反应，将盛有清洗液的一个染色缸在48℃震荡水浴锅中预热，把膜片放入预热后的清洗液中，震荡洗涤膜片20‑25min，取出膜片放至浸湿无菌水的无菌滤纸上洗去膜片下面的洗脱液；(4)结果观察将膜片放到载玻片上在荧光显微镜4×或10×下观察计数，采用蓝光激发，随机观察30‑40个视野的微菌落，按下式计算样本中的菌落数： X = A 40 × ( Φ 1 Φ 2 ) 2 ÷ V X为样本菌落总数，单位是cfu/ml；A为30‑40个视野微菌落总数，单位是cfu；Φ1为滤膜有效过滤直径，单位是mm；Φ2为油镜视野直径，单位是mm，V为滤过的样液量，单位是ml，计数后采用红光激发，观察荧光原位杂交实验结果，并对菌进行定性分析。