一种牡丹原生质体的提取方法

摘要

本发明公开了一种牡丹原生质体的提取方法，首先诱导牡丹种子萌发，取5-10天的子叶和/或下胚轴，培养愈伤组织，培养过程中采用变温培养，即每天在0-10℃条件下暗培养8-10小时，在15-30℃条件下光照培养14-16小时；然后用酶液从愈伤组织中游离原生质体，再分离、提纯得到牡丹原生质体。本发明牡丹原生质体的提取方法，对牡丹种子的萌发及愈伤组织的培养采用变温培养，时常变温使组织细胞在冷热交替的刺激下，变得疏松易分散，有利于原生质体在游离过程中保持较高的活力，得到高活力的牡丹原生质体，最终提取得到的牡丹原生质体经染色法鉴别其活力在85%以上，适合采用突变、转基因和细胞融合等遗传操作诱导新品种。

主权项

一种牡丹原生质体的提取方法，其特征在于：其步骤如下：1）取胚已进入成熟期的牡丹种子，酒精浸泡、灭菌，接种在pH为4.8‑6.5的MS培养基中，诱导牡丹成熟胚萌发；2）取步骤1）萌发5‑10天的子叶和/或下胚轴，切碎，接入pH为4.8‑6.5的MS培养基中，变温培养连续继代两次以上，获得愈伤组织，所述变温培养即每天在0‑10℃条件下暗培养8‑10小时，在15‑30℃条件下光照培养14‑16小时；本步骤所述MS培养基中含有6‑苄基腺嘌呤（6‑BA）0.1～1.5 mg/L，2，4‑二氯苯氧乙酸（2，4‑D）0.5～3 mg/L，蔗糖2‑5%和琼脂0.6‑0.8%；3）取步骤2）得到的愈伤组织，置于pH为4.8‑6.5的酶液中18‑28℃震荡12‑16小时游离原生质体，所述酶液为含有以下组分及含量的水溶液：纤维素酶1%～3%，半纤维素酶0.5%～1%，果胶酶0.5%～2%，甘露醇0.3‑0.7 mol/L，2‑（N‑吗啡啉）乙磺酸（MES）0.05‑0.3%，CaCl20.01‑0.2 mol/L；4）将游离原生质体后的酶液用100‑800目滤网过滤，滤液离心弃上清液，加入CaCl2洗液混匀，然后从溶液底部注入蔗糖溶液，离心取得处于中间部分的牡丹原生质体。