用于测定蛋白磷酸酶和激酶活性的基于FRET的方法

摘要

本披露涉及测定蛋白磷酸酶和激酶活性的方法。本披露还涉及患者中钙依赖磷酸酶活性和免疫抑制的临床监测方法，并且该方法可用于预测患者中的移植接受性。

主权项

一种用于测定肽修饰酶活性的方法，该方法包括：(a)提供一种分析反应混合物，包括：一种目标肽，包含一种被肽修饰酶特异性识别的氨基酸序列以及一种结合到所述目标肽的第一荧光团种类；一种缓冲混合物，它被配置成允许肽修饰酶修饰该目标肽；以及，一种测试样品，它被怀疑含有肽修饰酶；(b)在适宜于肽修饰酶的条件下温育该分析反应混合物以形成一种被修饰的目标肽；(c)在适于二氧化钛结合到一种被修饰的目标肽上但不结合到一种未被修饰的目标肽上的条件下，使该温育的反应混合物与二氧化钛接触，所述二氧化钛具有结合在其上的一种第二荧光团种类；(d)以该第二荧光团种类的激发波长照射该二氧化钛，由此，该第二荧光团种类发射一种第一荧光，所述第一荧光通过FRET激发该第一荧光团种类，从而诱导从该第一荧光团种类发射一种第二荧光，所述第二荧光的波长不同于该第一荧光的波长；(e)选择性地检测该第二荧光，从而检测一种被修饰的目标肽与二氧化钛的结合；(f)测定该第二荧光的强度；以及(g)使该第二荧光的强度与结合到该二氧化钛的、被修饰的目标肽的量关联。