利用液相芯片检测流感病毒的方法

摘要

本发明公开了一种利用液相芯片检测流感病毒的方法。该检测方法对所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亚型进行同源性分析，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针；采用一种改良的巢式PCR方法即使用不同长度的嵌套式引物进行PCR扩增；特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性探针的混合微球温育杂交，最后用Luminex 100进行检测。本发明的检测方法具有较高的特异性及灵敏度，并且检测速度快，能够对流感病毒的流行进行识别和监控。

主权项

一种检测流感病毒的液相芯片，其特征在于：该液相芯片是通过如下步骤制得的：利用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对Genbank中能够检索到的所有流感病毒A型、流感病毒B型的Non Structural核酸序列及流感病毒A型的H1、H2、H3、H5、H7、H9和N1、N2亚型核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相应基因片段的引物和特异性探针；引物使用改良的嵌套式引物，即采用较短的外引物(15‑20bp)和5’端加有一段通用引物(15‑20bp)的较长的内引物(35‑50bp)，通用引物的一个5’端用biotin标记，特异性探针5’端进行氨基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；最终合成的引物及探针序列如下：外引物：H1：5’‑AGG GCA TTT CGC TGA CTA TGA‑3’    5’‑ATT TAT GCT TGG CGG GTG AT‑3’H2：5’‑TGA TAG GCT TCT AAG GGT G‑3’    5’‑CTC CGC TCG TAT TGT TGT‑3’H3：5’‑GA ATG TRA CAA TGC CTA AYA A‑3’    5’‑CCA GGT TTY ACA ATG GTC C‑3’H5：5’‑GG ACA ATT TTR AAR CCR AAT G‑3’    5’‑TTA TCG CMC CCA YTG GAG‑3’H7：5’‑CTG AAA CGG TGG AAC GAA‑3’    5’‑AGT CAT CTG CGG GAA AGC‑3’H9：5’‑AGR ART ATG AGA TGG CTG AC‑3’    5’‑CCT GGY TTT ART ACY GAC C‑3’N1：5’‑GGR AAC AYA ATA TCA RTA TGG‑3’    5’‑ACA TCC CCT TTG GAA CCA‑3’N2：5’‑GAA TTC CTC ATC GAA CCC TA‑3’    5’‑AGT CCC ATT GAT ACA AAC GC‑3’InfA：5’‑CTT CTA ACC GAG GTC GAA A‑3’      5’‑G GCA TTT TGG ACA AAK CGT‑3’InfB：5’‑ACA AAT TGA GGT GGG TCC‑3’      5’‑C AGG GTA GTC AAG GGC T‑3’内引物：H1：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc GAC TAT GAG GAA CTG AGG GAG CAA T‑3’  5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc GTG ATG AAC ACC CCA TAG TAC AAG G ‑3H2：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc TAA GGG TGC CAG AAT GGT CCT ATA T‑3’ 5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc TTG TTG TAC GAT CCT TTG GCA ACC G‑3’H3：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc CTA AYA ATC NCT A RT TGC CTC‑3’      5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc ATG GTC CCA TTG GRA TGC TYC C‑3’H5：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc CCR AAT GTG GAC AAA GTG GAA GAA T‑3’      5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc YTG GAG GCA TAC TRG AAT TTA TAG‑3’H7：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc GAA CGA ACA AAC GTC TGT GTT TGA C‑3’  5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc GAA AGC AGC ATT GTC TGT GTT TGA C‑3’H9：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc TGG CTG ACG GGG HAT ACA YCA YCC‑3’    5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc ACY GAC CTA CCA HGG RGC AAT TAG‑3’N1：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc RTA TGG CAA TTC ATC TCT TTG YCC‑3’      5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc GAA CCA CAC CCA CAG GAC AAC TC‑3’N2：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc CGA ACC CTA TTA ATG AAT GAG TTG G‑3’    5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc TTG ATA CAA ACG CAT TCC GAC TCC T‑3’InfA：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc GTC GAA A GAY ACR ATC TGG AAT GT‑3’    5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc ACA AAK CGT CAC TTG TTG TKG TGT C‑3’InfB：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc GGG TCC ACA ATG GRA TGY TRT G‑3’      5’‑tcc tgt act ctc tta ctg tc AAG GGC TCT CAT RCT YCT GTA G‑3’通用引物：5’‑acg tgt tac tcg cat agt gc‑3’5’‑biotin‑tcc tgt act ctc tta ctg tc‑3’特异性探针序列：H1：5’‑NH2‑aaaaa CAT TCT TTC CCG TCA GCC‑3’H2：5’‑NH2‑GAA ATG TTT TAC GCT GCT GAG GAG AT‑3’H3：5’‑NH2‑CGA GTA ACA GTY TCA ACA RAA AGA AG‑3’H5：5’‑NH2‑TAT GCA TAC AAA ATT GTC AAG AAR GG‑3’H7：5’‑NH2‑TCA ATT CCG CCT GAC TCC CTG AGA A‑3’H9：5’‑NH2‑AC CCT RTt CAA GAC GCY CAA TAY AC‑3’N1：5’‑NH2‑AGC ATC AAT TTT TAC ACT GAG CAG G‑3’N2：5’‑NH2‑GTC CTG AGG ATA TTT TGA GAC CAT GAA C‑3’InfA：5’‑NH2‑aaaaa TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA‑3’InfB：5’‑NH2‑aaa CTG GAG TGC TAT GAA AGG CTT TC‑3’。