用pHsh表达系统制备重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶的方法

摘要

一种重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶的制备方法，其制法是：首先提取嗜热菌的基因组DNA，通过PCR扩增获得异构酶基因，将该基因插入基因表达载体pHsh，转化大肠杆菌获得异构酶表达质粒；其次是对基因进行诱变，改变密码子使用频次和mRNA的二级结构，得到优化的异构酶表达质粒；然后将异构酶表达质粒或优化的异构酶表达质粒转入大肠杆菌，得到基因工程菌，并通过热激诱导，使木糖/葡萄糖异构酶得到表达；最后收集细胞，破壁、离心后得到粗酶液，进一步纯化后得到纯度达90％的重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶。本发明首次使用表达载体pHsh对嗜热菌的耐热性木糖/葡萄糖异构酶基因进行高效表达，应用该技术生产重组酶，产量超过200mg/L，稳定性好，易于工业化生产。

主权项

一种用pHsh表达系统制备重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶的方法，其特征在于，用表达载体pHsh表达耐热性木糖/葡萄糖异构酶基因或其突变体，得到重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶，制备该酶的方法步骤如下：(1)从嗜热菌中提取基因组DNA，通过PCR扩增获得耐热性木糖/葡萄糖异构酶基因，并将该基因插入表达载体pHsh，构建成异构酶表达质粒；(2)对异构酶表达质粒中的mRNA翻译起始区潜在的二级结构及密码子频次进行在线分析，并通过基因诱变打破mRNA的茎环结构、降低自由能和减少稀有密码子，得到优化的异构酶表达质粒；其中所述基因诱变的方法是：对海栖热袍菌或那不勒斯热袍菌的基因xylA设计改变基因内部碱基的突变引物为，引物1：5’‑TATAT CTCCT TCTTGTCGAC TTTTA ACAGG TGATT GGATC ATGG‑3’，引物2：5’‑CCCAT GGCCG AATTCTTCCC CGAAA TTCCA AAGAT TCAGT TTGAA GGT‑3’，以异构酶表达质粒为模板进行定点诱变；(3)用异构酶表达质粒或优化的异构酶表达质粒转化大肠杆菌获得基因工程菌，并在基因工程菌的生长过程中进行热激诱导，使木糖/葡萄糖异构酶得到表达；(4)收集细胞，破壁并离心获得粗酶液；(5)对上述粗酶液中的重组酶进行纯化得到纯化的重组耐热性木糖/葡萄糖异构酶。