一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法。贻贝粘蛋白中含有L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)基团，其赖氨酸带有强正电荷，可形成静电键。采用CM系列这种连接了羧甲基(O-CH2COO-)的离子交换介质分离纯化贻贝粘蛋白，较其他种类离子交换介质的选择性高、收率高。采用强酸提取，以脱盐柱去除小分子化合物，利用琼脂糖基质的羧甲基离子交换介质结合凝胶过滤介质分离纯化贻贝粘蛋白，采用乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过四氮唑蓝特异性显色鉴别贻贝粘蛋白，提高了活性贻贝粘蛋白的收率。

主权项

一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法，结合凝胶过滤色谱，提供一种高收率的贻贝粘蛋白纯化方法，其技术特征在于，包括如下的步骤：1)以0.5‑2.5％高氯酸或/和1‑10％乙酸为提取溶剂，100g贻贝足丝加300‑1000ml提取溶剂，10‑25℃浸提10‑20min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其悬浮于提取溶剂中；2)以10000‑16000r/min离心30‑50min或以45μm滤膜过滤去除残渣，保留上清；3)用Sephadex G‑25或G‑50去除小分子化合物，流动相为pH 2.0‑6.0的10‑80mM的醋酸钠缓冲液，添加0.1‑0.6M氯化钠，收集穿透峰；4)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；5)采用CM Sepharose FF离子交换介质，流动相pH3‑6之间，吸附流动相为0.1‑0.5M氯化钠，洗脱采用10‑20柱体积内0.5‑1.2M氯化钠线性梯度洗脱；6)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；7)采用Superdex 200或Sephacryl S‑200凝胶过滤介质，以0.1‑0.6M氯化钠和0.5‑4％柠檬酸或1‑5％乙酸为流动相；8)以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓缩馏分；9)用0.5‑3％的柠檬酸4℃透析，4℃保存；10)从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白：采用12‑20％浓度十二烷基磺酸钠(SDS)‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，硝酸银染色，10‑25℃染色2‑4h，以高分子量标准蛋白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD；11)四氮唑蓝特异性染色：采用12‑20％浓度乙酸‑尿素(Acetic acid‑Urea)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色液采用pH10的NBT‑氨基乙酸溶液，10‑25℃染色1‑3h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。