基于纳米探针直接检测肺癌样品中P53基因突变的方法

摘要

本发明涉及的是一种基于纳米探针直接检测肺癌样品中p53基因突变的方法，其特征在于未标记的靶核酸序列以及纳米金标记的信号探针与固相支持物连接的捕获探针进行的夹心杂交，并通过银染增强的纳米金信号放大效应产生高灵敏的识别信号。该方法能够检测未扩增的基因组DNA样品中的单碱基突变。与传统的基于荧光信号检测的方法相比，本发明提供的纳米芯片检测方法大大提高了检测的灵敏度和特异性，并可通过普通的光学扫描仪或者普通的电荷藕合器件(CCD)数字照相机就可以对杂交信号进行采集和分析，也可通过相关软件进行分析，得出检验报告。

主权项

1.一种基于纳米探针直接检测肺癌样品中P53基因突变的纳米探针芯片，其特征在于由以下方法制备：未标记的靶核酸序列以及纳米金标记的信号探针与固相支持物连接的捕获探针进行夹心杂交，并通过银染增强液使信号放大进行检测；所述的方法包括探针的设计和纳米探针芯片的制备、待测样品的处理和纳米探针的制备、杂交和检测三部分，具体为：A.探针的设计和纳米探针芯片的制备①根据肺癌中P53基因5-8外显子中常见突变信息设计相应探针，其中每个SNP位点至少有两个探针，即一个野生型，一个突变型；每个SNP位点设计尽量位于探针的中间，碱基长度为16-25bp，固定在修饰好的玻片上，探针的5’末端需加16个长度T的连接臂和氨基修饰；根据临近SNP位点的靶DNA序列设计带有巯基的信号探针，碱基数不超过40bp，TM值温度相等；②纳米探针芯片的制备：将氨基修饰的捕捉探针通过芯片点样仪点在醛基修饰的玻片上，37℃度固定，制备检测P53基因突变的纳米探针芯片；B.待测样品的处理和纳米探针的制备①待测样品的处理：通过蛋白酶K消化法、快速高盐提取法、CTAB法或SDS裂解法方法抽提基因组DNA，然后将基因组DNA降解成500-1000bp的片段；②用纳米金颗粒标记带有巯基修饰的信号探针制备纳米探针：纳米探针的标记方法为：30nm的纳米金200μl加巯基修饰的寡核苷酸探针100umol/L，11μl，室温下放置24小时得混合液，然后2M NaCl和1×PB加入到所述的混合液中，使NaCl浓度达到0.075M，2小时后继续加入NaCl，并调整NaCl浓度到0.1M，继续放置84小时后，纳米金颗粒通过12000rpm离心进行分离；C.杂交和检测①标记了纳米金的纳米探针与芯片上的捕捉探针以及靶DNA的两步连续的杂交：所述的纳米探针芯片的第一步杂交是取步骤B中①降解成500-1000bp的基因组DNA 5μl加10μl杂交液混合，滴于芯片阵列处，盖上盖玻片，置于50℃杂交箱中杂交半个小时，使DNA样品与芯片上的特异性捕捉探针结合；然后室温下取出芯片，在0.5M的NaNO₃中洗30秒；第二步杂交是将纳米金标记的纳米探针2μl与10μl的杂交液混合后添加在阵列处，50℃杂交箱中杂交20-30分钟，然后0.5M的NaNO₃中清洗三次；②检测方法是通过银染显色的方法，利用银染增强液试剂的氧化还原反应中形成的银颗粒聚集在纳米金上，而使杂交信号放大，所述的银染显色方法是：在芯片阵列处加上新配制的银染增强液，盖上盖玻片，37℃反应15分钟，结束后去掉盖片，超纯水清洗且氮气吹干；使用光学显微镜观察或者电荷藕合CCD器件照相采集以及普通光学扫描仪扫描记录芯片上的信息；根据P53基因DNA序列信息设计的探针为：纳米探针芯片的短阵为：cA：1～10：阳性内参照探针阳性内参照和阴性内参照之间只差一个碱基；第一步杂交使用的基因组浓度为100ng/μl；第二步杂交后用0.5M的NaNO₃清洗时，每次30秒；银染增强液组成为：1％明胶                                60μl2.55g柠檬酸/2.35g柠檬酸三钠/10ml H₂O； 10μl1.7g氢醌/30ml H₂O，                    30μl0.5g AgNO₃2ml H₂O；                    1.2μl；步骤B中①所述的基因组DNA降解成500-1000bp是通过超声波或限制性内切酶切断DNA的方法实施的。