一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法

摘要

一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，采用以毕赤酵母做载体的产植酸酶基因工程菌的发酵生产工艺，其特征在于以甘油为碳源，取适量生产用菌种，在种子培养基中摇瓶培养，再经一级种子培养、二级种子培养、发酵培养工序，在种子培养及发酵产酶前的菌体生长阶段的唯一碳源为甘油；发酵培养时，在基础发酵培养基液中甘油消耗完全后，开始流加50％甘油溶液至培养基中，待甘油耗尽后，开始流加甲醇诱导产植酸酶，在生产阶段甲醇还充当碳源。积极效果是：甘油作为碳源使最终产植酸酶量增加20-30％，酶活力提高20％-30％，发酵液颜色浅不需脱色处理，降低生产费用，本方法比传统工艺降低成本1/3左右。

主权项

一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法，采用以毕赤酵母做载体的产植酸酶基因工程菌的发酵生产工艺，其特征在于该发酵生产工艺的步骤包括：以甘油为碳源，取适量生产用菌种，在种子培养基中摇瓶培养，再经一级种子培养、二级种子培养以及生产发酵的工序；其中种子培养基的配方为：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，酵母粉0.1～2％，其中甘油按体积百分比计，其余按重量百分比计，其余是水；其中生产发酵工序的步骤为：a.在20吨容积的不锈钢发酵罐中投入相当于罐容积的35～40％的发酵培养基，经消毒、接种、流加等工序，至停止发酵时发酵液体积增加到罐体积的70-75％；b.无菌状态接入二级种子，培养发酵：30℃，180～250pm，恒定pH 5.0，通气量1～2vvm；c.流加甘油当发酵培养基中甘油利用完全后，采用甘油检测方法测定甘油含量为0时，再进行下步补料流加工序：(1)配制甘油水溶液，按体积百分比计，浓度为50％，再添加微量元素PTM1，为培养基体积的0.2～2％，灭菌降温备用；(2)以10-50ml/h/l的流速流加体积百分比为50％的甘油水溶液至发酵培养基中；(3)甘油匀速流加时间为4h或更长时间，至细菌生产量为200～250g湿重/L发酵液无可见的重组蛋白的产生；d.诱导(1)配制诱导剂：在浓度99％以上的甲醇中添加0.2-2％PTM1，按体积百分比计；(2)当流加的甘油利用完全后，再进行流加甲醇；(3)诱导剂流加饲喂，速度为1-10ml/h/L起始发酵液体积；(4)在开始3-5小时，酵母对碳源的适应期中甲醇在发酵液中累积，当培养物适应甲醇后，将消耗甲醇；(5)甲醇作为毕赤酵母工程菌的诱导剂，诱导其产植酸酶；(6)随着培养的持续及目的产物的快速生成，应相应增大发酵液中的溶氧，溶氧值大于30％；(7)整个甲醇流加过程持续约70-100小时；e.生产发酵过程结束：当细菌镜检发现细菌开始自溶时，酶活力降至3000u/g以下，停止发酵。