一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，是采集水样后进行优势藻种培养分离，然后采用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况，采用脂溶性的荧光染料尼罗红对微藻进行染色，利用荧光酶标仪，485nm激发光，575nm消散光用于定量检测微藻细胞脂的含量，最终确定纯种藻株后做藻种保藏。本发明筛选过程变得简便、高效，可从自然水体大规模、高效、快速分离高油脂、高生长速率微藻种质，在微藻分离的同时，整合生物量、油脂含量的同步监测，一步筛选出合适的藻种，整个分离、筛选、检测过程中无需改变培养容器，能实现高通量筛选，通过不同的检测程序一步得到目标藻株，大大提高筛选的工作效率。

主权项

1、一种快速筛选高油脂含量微藻种质的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)自然水体样品的采集自海洋、湖泊、河流或水塘采集有可能生长所需单胞藻的水体为水样，然后将水样经350目筛绢过滤以除去浮游生物；2)样品的培养分离配制AE1，AE2，AE3，AE4四种培养基，将每种培养基按12个浓度梯度放入具有96孔的培养板中；将采集的自然水样混匀，然后加入50-200μg/ml氨苄青霉素、50-100μg/ml卡那霉素和50-100μg/ml庆大霉素；将水样按照1∶20的体积比分别接种于培养基AE1，AE2，AE3，AE4四种培养基中；将培养板置于温度为21～28℃，光照强度为1500～5000LUX的条件下培养，利用不同的藻种最适培养基的成分和浓度之间的差异，在不同的培养基种类和浓度条件下就有不同的最适生长微藻，当某种微藻大量增值，形成优势种群后，在群落间的竞争背景下，非优势种渐渐衰落，优势种渐渐增强，最终非优势种死亡，仅剩下优势藻种生长，达到分离的目的；上述四种培养基的成分如下：①.AE1：NaNO3 0.2～0.4g.L-1，K2HPO4·3H2O 0.05～0.08g.L-1，MgSO4·7H2O 0.05～0.09g.L-1，CaCl2·2H2O 0.02～0.05g.L-1，KH2PO40.1～0.3g.L-1，NaCl 0.02～0.5g.L-1，Soil extract 40ml，FeCl3·6H2O 0.002～0.006g.L-1，Fe-EDTA 0.05～0.1g.L-1，H3BO3 2.0～3.0g.L-1，MnCl2·4H2O 1.0～2.0g.L-1，ZnSO4·7H2O 0.15～0.30g.L-1，CuSO4·5H2O 0.60～0.90g.L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.2～0.5g.L-1；②.AE2：NaNO3 1～3g.L-1，K2HPO4·3H2O 0.03～0.05g.L-1，MgSO4·7H2O 0.05～0.08g.L-1，CaCl2·2H2O 0.03～0.05g.L-1，citricacid 0.005～0.007g.L-1，Ferric ammonium citrate 0.005～0.007gL-1，EDTA 0.001～0.002g.L-1，Na2CO3 0.01～0.03g.L-1，H3BO3 2.0～3.0g.L-1，MnCl2·4H2O 1.0～2.0g.L-1，ZnSO4·7H2O 0.15～0.30g.L-1，CuSO4·5H2O 0.60～0.90g.L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25～0.45g.L-1，CoCl2·6H2O 0.03～0.05g.L-1；③.AE3：Tris Base 2～3g.L-1，Glacial acetic acid 1～3ml.L-1，K2HPO4 0.1～0.2g.L-1，KH2PO4 0.05～0.08g.L-1，NH4Cl 0.03～0.05g.L-1，MgSO4·7H2O 0.01～0.02g.L-1，CaCl2·2H2O 0.005～0.07g.L-1，H3PO4 0.001～0.003g.L-1，MnCl2·4H2O 0.004～0.006g.L-1，ZnSO4·7H2O0.02～0.03g.L-1，FeSO4·7H2O 0.004～0.006g.L-1，CoCl2·2H2O 0.001～0.002g.L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001～0.002g.L-1；④.AE4：NaNO3 0.3～0.5g.L-1，CO(NH2)2 0.1～0.3g.L-1，K2HPO4·3H2O 0.05～0.1g.L-1，FeC6H5O7 0.005～0.008g.L-1，CaCl2·2H2O 0.02～0.3g.L-1，Soil extract 10ml.L-1，Vb1 200～300ug.L-1，Vb12 400～500ng.L-1，H3PO4 0.001～0.003g.L-1，MnCl2·4H2O 0.004～0.006g.L-1，ZnSO4·7H2O 0.02～0.03g.L-1，FeSO4·7H2O 0.004～0.006g.L-1，CoCl2·2H2O 0.001～0.002g.L-1，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001～0.002g.L-1；3)生长速率和生物量的监测根据微藻细胞在490nm处的吸光值和细胞密度呈显著的正相关性，吸收值越大，藻的浓度就越大；利用酶标仪检测490nm处的吸光值来快速反映藻类的生长情况；每隔12～24小时用酶标仪监测光吸收值来快速反映藻类的生长情况，绘制每个培养小室的微藻生长曲线，计算生长速率，同时用倒置显微镜观察藻细胞的生长状况及培养纯度；4)样品含油量的监测监测藻细胞生长，待细胞生长到平台期，根据微藻具有活体原位测定的特性，将微藻经尼罗红染色后，用荧光酶标仪检测光密度值以确定为微藻的含油量，从而筛选到适合生产生物柴油的理想微藻种质；5)微藻种质的最后纯化和镜检根据所筛选到的目的藻种相对应小室内的培养基的种类和浓度制做固体培养平板，取该小室的微藻做平板划线，待长出单藻落后，从平板上挑取直径较大的藻落再做一次平板划线，得到生长速度较快和细胞体积较大的藻种的优秀藻株，同时在400X显微镜下观察该种微藻的形态和均一度，最终确定为纯种藻株后，做藻种保藏。