甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法

摘要

一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，包括以下步骤：1.用打气泵吹气法吹提样品蔗汁；2.离心法制备样液；3.I－ELISA法检测甘蔗宿根矮化病菌RSD；该方法克服了传统的剖茎检测法和相差显微镜检测法准确性差、操作繁琐、灵敏度低，PCR检测法体系难于稳定等不足，能简便、快速、准确、有效的检测出甘蔗宿根矮化病菌RSD，适合田间大批量样品的快速检测，为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。

主权项

1、一种甘蔗宿根矮化病菌的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)、样品蔗汁提取：每个待测甘蔗样品取5～6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用刀切成12～16cm长，用打气泵吹2～3ml的甘蔗汁于离心管内，置于冰上，带回室内放于-18℃冰箱保存备用；2)、样液制备：取上一步骤提取的待测蔗汁1000ul于离心管旋涡混合器中震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀再加1000ul包被缓冲液，旋涡混合器震荡混匀后13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加300ul包被缓冲液稀释混匀得到样液；3)、I-ELISA检测：(1)上样：分别将上述制备好的样液加入ELISA酶标板反应孔，每孔100ul，同时设置阳性对照用包被缓冲液按重量份1：50稀释、阴性对照用健康蔗汁制备和空白对照用PBST溶液，每个样品重复，盖上盖子，37℃恒温培养过夜；用含0.05％吐温的磷酸盐缓冲液慢洗2次，每次5min，拍干；(2)封闭：每孔加200ul含5％脱脂奶粉的PBST溶液，室温封闭30min，PBST缓冲液同上慢洗1次，拍干；(3)加抗体：每孔加100ul含0.1％RSD特异性抗血清和含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗1次，拍干；(4)加酶标抗体：每孔加100ul含0.01％碱性磷酸酶标记羊抗兔酶标抗体、含2.5％脱脂奶粉的PBST缓冲液，室温孵育1.5h，PBST缓冲液慢洗5次，拍干；(5)显色：每孔加100ul底物/缓冲液，1mg/ml稀释，加入酶标板，室温下充分显色；4)、结果判别：在BIO—RAD Model 550型酶标仪405nm波长下分别读取每个样品0小时和充分显色后的OD值，每个样品充分显色后的OD值减去0小时OD值的差大于0.15为阳性，小于0.05为阴性，在0.05～0.15之间为可疑。