早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法

摘要

早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，涉及CK19mRNA、CK20mRNA及CEAmRNA检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移方法。提供采用分子生物学手段综合CK19mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA三项指标，微量准确快速检测上皮性消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法。步骤为采血，离心，获取血液中的有核细胞，提取总RNA，RNA检测并鉴定其完整性，要求OD₂₆₀/OD₂₈₀比值＞1.8，合成cDNA第一链，对CK19c DNA和CK20c DNA的巢式PCR扩增，再对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增，三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移后统计学计算。

主权项

1、早期检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移的方法，其特征在于具体步骤如下：1)采血：抽取外周静脉血3～5mL，注入含肝素钠的洁净试管中；2)准备离心：取步骤1)所得的肝素抗凝静脉血与Hank氏液等量混匀，分别在两支试管中加入2～4mL的淋巴细胞分离液，再将上述混合液5～10mL叠加于淋巴细胞分离液的液面上；3)获取血液中的有核细胞：将步骤2)中的试管经2000～2500g水平离心15～20min后溶液分为3层，上层为血浆和Hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以有核细胞为主的白色狭窄带，用干净毛细管插到该白色狭窄带层，吸出有核细胞，并移入试管中，加入1～5mL Hank氏液，洗涤细胞，1500～2000g水平离心10～15min，弃上清液；4)提取总RNA：在已经洗涤过的有核细胞沉淀中加入Trizol试剂1～5mL，消化3～5min；将细胞裂解液吸到EP管中，加氯仿0.2～1.0mL，轻摇15～60s，室温静置5～10min，10000～12000g离心10～15min，取上清无色水相液到EP管中，加异丙醇0.5～1.5mL，静置10～20min，10000～12000g离心10～15min，弃上清，在管底见微量白色总RNA沉淀；5)RNA检测：用无水乙醇洗涤RNA沉淀后，10000～12000g离心5～10min，吸尽上清液，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10～20μL，打匀，55～60℃水浴10-20min溶解总RNA，测OD260和OD280值，检测其纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取RNA的完整性；6)若OD260/OD280比值＞1.8，说明RNA的纯度较高，则进入后续实验；若OD260/OD280比值＜1.8，说明RNA的纯度不够，应重复步骤4)，直至符合要求即OD260/OD280比值＞1.8为止；若在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的RNA带，说明RNA质量较高，降解较少，否则应重新提取总RNA；7)cDNA第一链的合成：取上述总RNA 1～5μL于EP管中，70℃水浴10min，在冰浴中依次加入：0ligo(dT)15引物1μL，10×缓冲液2μL，dNTPs 2μL，RNasin 0.5μL，AMV反转录酶4.3μL(3.5u/μL)，双蒸水5.2～9.2μL，混匀，整个反应体系移42℃孵育15min，接着95℃ 5min，最后0～5℃ 5min，经反转录获得各种cDNA的第一链；8)CK19 cDNA的巢式PCR扩增：对CK19的cDNA第一链进行巢式PCR扩增和检测的第一轮扩增体系包括：反转录产物3～5μL，无菌双蒸水11.8～13.8μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 A(5′GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3′)和CK19 B(5′ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL；反应条件如下：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次；第一轮PCR扩增后立即进行第二轮PCR扩增，反应体系包括：第一轮PCR扩增产物0.5μL，无菌双蒸水16.3μL，10×缓冲液2.5μL，dNTPs 2.0μL，CK19 C(5′CGAGCAGAACCGGAA3′)和CK19 D(5′TGAGCCG CTGGTACTCCTGAT 3′)各1.0μL(10pmol/μL)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，MgCl2 1.5μL，共25μL，第2轮PCR扩增除退火温度为52℃外，其余反应条件同第一轮反应。取上述巢式第二轮PCR扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记阳性或阴性结果并与临床分期和病理结果进行比对；9)CK20 cDNA的巢式PCR扩增：CK20巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，第一轮扩增引物为CK20 A(5′CAGACACACGGTGAACTATGG 3′)和CK20 B(5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG 3′)。反应条件：94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸30s，循环35次；第二轮扩增引物为CK20 C(5′CTGTTTGTTGG CAATGAGAAAATGG 3′)和CK20 D(5′GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT3′)，退火温度为62℃ 1min，72℃延伸30s，循环35次；扩增后取扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；10)对CEA的cDNA第一链进行巢式PCR扩增：CEA巢式PCR扩增的体系类似CK19，在提取获得纯度较高的RNA后，将其中的mRNA反转录为cDNA，然后进行巢式PCR扩增，其第一轮引物为CEA A(5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG 3′)和CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTAAGGAAGAAGC 3′)，反应条件：先94℃预热5min，接着94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，循环22次；第二轮扩增的引物为CEA B(5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′)和CEA C(5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3′)，反应条件同上述第一轮；反应后取扩增产物4～8μL在1.0％～1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并扫描成像，登记并与临床分期和病理结果进行比对；11)三项指标联合检测消化道肿瘤细胞经外周血微转移：对待检者按上述步骤依次检测外周静脉血中有核细胞的CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA，并将三项结果一并考察，只要其中任何一项为阳性，该待检者体内发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性高达91.9％。如果三项检测都为阴性，则提示发生消化道肿瘤细胞微转移的可能性很小；12)统计学计算：用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，消化道肿瘤按国际抗癌协会UICC的TNM标准进行分期，各期阳性率的比较采用x2检验，以P＜0.05作为显著性差异的判断标准。