微生物源河豚毒素的制备方法

摘要

本发明公开了属于生物制剂制备技术领域的微生物源河豚毒素的制备方法。利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中超滤、离子交换柱层析及HPLC相结合的技术提取，得到高纯度的河豚毒素。以海洋微生物发酵法产生河豚毒素，原料来源广、成本低，不受季节和原料的限制，不破坏生态平衡；工艺易控制，产品纯度高。河豚毒素纯度达99％以上，生物检测法检测其毒性约为4MU/1mg。

主权项

1.一种微生物源河豚毒素的制备方法，其特征在于：利用从河豚卵巢中分离的河豚毒素高产菌株，通过微生物发酵产生河豚毒素，并运用生化分离技术从发酵产物中提取、纯化河豚毒素，实现微生物源河豚毒素的制备工艺为：1).种子液培养：将河豚毒素产生菌株在伊莫松培养基斜面上25～35℃下活化20～30h，接一环菌分散于盛有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，28℃下160rpm振荡培养20～30h，作为种子液；2).发酵：将种子液以7％的接种量接种于发酵培养基中28℃下发酵，发酵时间控制在40～55h，以发酵液pH值达到7.4为发酵指示终点；3).分离、去沉淀：立即将合并的发酵液调至pH4；发酵液4℃下经10,000rpm高速离心20min，去除沉淀；4).过滤：上清液超滤，去除分子量大于3000 dalton的杂质；吸液浓缩后，冻干；5).成品收集：冻干粉以0.2％醋酸溶解，10000rpm离心20min，离子交换柱层析，0.5％醋酸作层析液，分步收集，生物检测法检测洗脱液毒性；合并含毒洗脱液，冻干后，再经HPLC精制得高纯度TTX。