一种猪凝血酶冻干粉的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：抗凝猪血浆与凝胶混合搅拌吸附，过柱洗脱获得凝血酶原溶液；向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl₂进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；猪凝血酶加入甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；冻干品在100℃下进行干热处理以再次灭活病毒，包装即得猪凝血酶冻干粉。产品中猪凝血酶比活性不低于130U/mg，整个工艺步骤简单、易实施，提高了制品安全性，适合于工业化生产。

主权项

一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗凝猪血浆与经过含有Na₂B₄O₇3.75mmol/L和H₃BO₃85mmol/L且pH值为8.0的硼酸‑硼砂缓冲液平衡的QAE‑SephadexA50凝胶按照1L:1～1.5g的用量混合，室温搅拌吸附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗至基线走平，再用0.1mol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0.4mol/L的NaCl和2mmol/L的BaCl₂的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液；(2)按兔脑粉与生理盐水为1g∶20mL的比例，向兔脑粉中加入45℃的生理盐水，保持45～50℃搅拌提取15～20分钟后，2000rpm离心5分钟，收集上清液；按照上清液:凝血酶原溶液:CaCl₂＝4.7mL:1L:1.4g的用量进行配比混合搅拌均匀后，于25～31℃水浴中静置激活1～2hr进行酶原激活，然后于4℃5000rpm离心10min，用双层400目绸布过滤，收集上清得凝血酶粗酶液；(3)凝血酶粗酶液用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩10～20倍，进液压控制在0.15M Pa以内，回流压控制在0.1MPa以内，浓缩后的粗酶液中加入病毒灭活剂搅拌均匀后，于24～26℃下保温6～8hr，进行病毒灭活；所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的吐温‑80；或者所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的TritonX‑100。(4)灭活病毒后的粗酶液过DEAE‑Sepharose Fast Flow层析柱，先用平衡液流洗至基线走平后，用洗脱液洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；(5)步骤(4)所得猪凝血酶加入终浓度为15～35g/L的甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；(6)猪凝血酶冻干品在100℃下进行干热处理30～120min以再次灭活病毒，然后进行包装，即得猪凝血酶冻干粉。