一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别方法

摘要

本发明提供了一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-连接糖链及其鉴别方法，以解决现有技术反应效率较低、可鉴定的糖链种类较少的问题。本发明利用8～12KD滤膜的分子筛效应，将从糖蛋白上释放的糖链与蛋白分离，在10KD分子筛上糖蛋白的N-连接糖链被PNGase F酶释放，通过反复离心的方法使N-连接糖链流出，蛋白仍保留于滤膜上，从而实现了糖链的分离。该方法分离糖链效果明显，并避免了因非特异性吸附和化学反应带入副产物；反应效率高、反应步骤简明。

主权项

一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N‑连接糖链的方法，包括以下步骤：(1)蛋白样品的预处理取蛋白样品加入超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，再加入弱碱性清洗液，再次离心从而尽可能去除杂质；另取一离心管，将8～12KD的超滤管倒置于该离心管中，然后离心，收集离出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；(2)定容的蛋白溶液中糖蛋白全N‑连接糖链分离将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，然后加入等体积的16M尿素溶液，在恒温振荡孵育器中振荡混合，然后离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中并进行离心，弃去离心管中的流出液；然后加入10～100mM NH₄HCO₃，振荡混合，离心；将超滤管转移至新的离心管中，向超滤管中加入反应缓冲液，振荡混合，再向超滤管中加入PNGase F酶液，振荡混合，37℃湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N‑连接糖链；或者，将定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超滤管并置于配套的离心管中，进行离心，加入等体积的16M尿素溶液，振荡混合，离心；再加入8M尿素溶液至超滤管中，离心，弃去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT二硫苏糖醇溶液并振荡混合，56℃静置孵育，离心；再加入10～100mM的碘乙酰胺或IAA碘乙酸溶液并振荡混合，暗处静置孵育，离心；再加8M尿素溶液至超滤管中，离心，至少重复1次；然后加反应缓冲液至超滤管中，离心，至少重复1次；将超滤管转移至新的离心管中，加入用40mM NH₄HCO₃溶解的PNGase F酶液，振荡混合，37℃的湿盒中静置孵育过夜，然后离心；再加超纯水至超滤管中后离心，收集流出液，并冷冻干燥，得到已分离的糖蛋白全N‑连接糖链。