琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺

摘要

本发明公开了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺方法，涉及如下步骤：(1)制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液；(2)菌种的10L罐扩培；(3)10L罐固定化细胞的制备；(4)10L罐单罐反复发酵：无菌接入新鲜培养基，第一批次控制发酵时间为24小时，以后连续发酵9个批次，发酵时间均为16小时，通过CO2和H2混合气流速控制兼性厌氧培养模式，发酵液的pH值通过流加氢氧化钙控制，每个批次发酵结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截流固定化细胞进行下一批次发酵，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上，完全实现了琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵。

主权项

琥珀酸的固定化细胞单罐高强度连续发酵工艺，其特征在于包括如下操作步骤：A、斜面菌种的准备将产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)ATCC55618划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板，在温度为34℃条件，进行CO2和H2混合气室培养1天，CO2和H2混合气的混合比例为1∶1，得斜面菌种作为原始种子；B、制备高活性产琥珀酸放线杆菌种子液斜面菌种直接接种于500mL三角瓶，装液200mL，在温度为34℃、摇瓶转速为100转/min条件下进行CO2和H2混合气培养18小时，CO2和H2混合气的混合比例为1∶1，得液体种子；培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖60g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨大豆肉汤5g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钠1.16g/L，磷酸氢二钠0.7g/L，氯化钠1.0g/L，氯化镁0.2g/L；发酵液体积为200mL，装液系数为0.4；C、菌种的10L罐扩培将培养18小时的液体种子直接接种于10L发酵罐内，液体体积为4L，在温度为34℃、搅拌转速为100转/min、在混合比为1∶1的CO2和H2混合气流速为0.03L/(min·L)条件下，进行兼性厌氧培养18小时，得高活性游离细胞菌液；培养基成分组成同B步骤；D、10L罐固定化细胞的制备向装有4L对数生长期的高活性游离细胞菌液的罐内添加400mL浓度为25％的无菌海藻酸钠溶液，控制该罐内细胞菌液的海藻酸钠浓度约2.5％，搅拌均匀，无菌流加至另一装有4L浓度2％氯化钙无菌水溶液的10L发酵罐内进行钙化处理，钙化时间为30min，调节流加速度10mL/min和采用直径1.0mm针头来控制固定化颗粒大小，控制固定化载体直径3.0-4.0mm范围内，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得粒径均匀的固定化细胞；E、10L罐单罐反复发酵将固定化细胞无菌接入新鲜培养基，第一批次发酵时间为24小时，设置温度为34 ℃，通过兼性厌氧培养模式，CO2和H2混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO2和H2的比例为1∶1，搅拌转速为100转/min，以后连续发酵9个批次，每次发酵时间均为16小时，设置温度为34℃，通过兼性厌氧培养模式，CO2和H2混合气的流速为0.02L/(min·L)，其中CO2和H2的比例为1∶1，采用直板式搅拌桨生物反应器，搅拌转速为100转/min；发酵液的pH值通过流加氢氧化钙控制为5.5，每个批次发酵结束后，进行无菌正压放料截流固定化细胞，补加入新鲜培养基至4L，进行下一批次发酵，在发酵进行至16h的时候，琥珀酸浓度大于50g/L，菌体蛋白浓度小于0.2％，发酵强度稳定在3.10g/(h·L)以上；所述新鲜培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖60g/L，酵母浸粉1.5g/L，胰蛋白胨大豆肉汤0.5g/L，玉米浆2.0g/L，磷酸二氢钠0.5g/L，磷酸氢二钠00.2g/L，氯化钠0.3g/L，氯化镁0.05g/L，罐内液体发酵培养基的总体积为4L。