NGR-VEGI融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法

摘要

本发明公开了一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其序列见SEQ ID NO.1，还公开了采用该基因编码的NGR-VEGI融合蛋白以及表达纯化NGR-VEGI融合蛋白的方法，该方法为：一、合成NGR-VEGI融合蛋白基因；二、构建得到融合蛋白原核表达载体；三、将融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；四、采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。本发明通过设计NGR-VEGI融合蛋白基因，将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，采用高浓度的蛋白诱导表达方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。

主权项

一种表达纯化NGR‑VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、采用人工方法合成NGR‑VEGI融合蛋白基因；所述NGR‑VEGI融合蛋白基因的序列如下：ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT     60ATGTGCAACG GCCGCTGCGT GAGCGGCTGC GCGGGCCGCT GCGGCAGCGG CCGCCAGACC     120CCGACCCAGC ATTTTAAAAA CCAGTTTCCG GCGCTGCATT GGGAACATGA ACTGGGCCTG     180GCGTTTACCA AAAACCGCAT GAACTATACC AACAAATTTC TGCTGATTCC GGAAAGCGGC     240GATTATTTTA TTTATAGCCA GGTGACCTTT CGCGGCATGA CCAGCGAATG CAGCGAAATT     300CGCCAGGCGG GCCGCCCGAA CAAACCGGAT AGCATTACCG TGGTGATTAC CAAAGTGACC     360GATAGCTATC CGGAACCGAC CCAGCTGCTG ATGGGCACCA AAAGCGTGTG CGAAGTGGGC     420AGCAACTGGT TTCAGCCGAT TTATCTGGGC GCGATGTTTA GCCTGCAGGA AGGCGATAAA     480CTGATGGTGA ACGTGAGCGA TATTAGCCTG GTGGATTATA CCAAAGAAGA TAAAACCTTT     540TTTGGCGCGT TTCTGCTGTA ACTCGAG                                         567；步骤二、构建融合蛋白原核表达载体：设计PCR引物F和R，对步骤一中所述NGR‑VEGI融合蛋白基因进行PCR扩增，引物序列如下：上游引物F: 5’‑ACCATATG GTATACACGTTGCCG‑3’下游引物R: 5’‑GTCTCGAGTTAGAGCAGAAACGC‑3’；将PCR产物的5’端融合NdeI酶切位点，3’端融合XhoI酶切位点，进行双酶切，然后装入PET‑28a载体，利用载体上的序列，N端融合His‑Tag，构建得到融合蛋白原核表达载体；步骤三、融合蛋白的诱导表达：将步骤二中所述融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；步骤四、融合蛋白的分离纯化：将步骤三中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR‑VEGI融合蛋白。