一种利用多维指纹图谱来控制决明子多糖质量的方法

摘要

本发明属于食品、药物分析领域，具体涉及一种利用指纹图谱来控制决明子多糖质量的方法。以决明子为原料，构建决明子多糖多维指纹图谱，包括构建决明子多糖GC指纹图谱、决明子多糖完全水解下的HPLC指纹图谱以及决明子多糖不完全水解下的HPLC指纹图谱，通过多维指纹图谱共同组成了完整的决明子多糖的指纹图谱特征。该多维指纹图谱可以用于对原料的质量控制。采用本发明可以对标准原料进行更为准确、全面的质量控制。

主权项

一种利用指纹图谱来有效检测决明子多糖质量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一、构建决明子标准品多糖标准指纹图谱：选取标准决明子原料，共10批次，分别构建决明子多糖GC标准指纹图谱、决明子多糖完全水解下的HPLC标准指纹图谱以及决明子多糖不完全水解下的HPLC标准指纹图谱，构建三维标准指纹图谱；所述决明子多糖GC标准指纹图谱的构建是先将决明子多糖标准品水解产物的糖腈乙酸酯衍生化，随后采用气相色谱法分析供试品溶液，最终获得决明子多糖GC指纹图谱；所述决明子多糖完全水解下的HPLC标准指纹图谱的构建是先将决明子多糖标准品进行完全水解，随后进行决明子多糖标准品水解产物的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化反应，再进行高效液相色谱的指纹分析，最终按照获得的结果绘制决明子多糖完全水解下的HPLC标准指纹图谱；所述决明子多糖不完全水解下的HPLC标准指纹图谱的构建是先将决明子多糖标准品进行不完全水解，随后进行决明子多糖标准品水解产物的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化反应，再进行高效液相色谱的指纹分析，最终按照获得的结果绘制决明子多糖不完全水解下的HPLC标准指纹图谱；步骤二、采用上述步骤一中决明子标准品多糖标准指纹图谱的确定方法，绘制实际送样决明子的决明子多糖GC指纹图谱、决明子多糖完全水解下的HPLC指纹图谱以及决明子多糖不完全水解下的HPLC指纹图谱；步骤三、将步骤二获得的结果分别与步骤一中的三维标准指纹图谱进行相似度评价，当相似度均大于90％以上，则表明所述实际送样中的决明子多糖合格；所述决明子多糖GC标准指纹图谱的构建具体包括如下步骤：(1)决明子多糖标准品水解产物的糖腈乙酸酯衍生化：将三氟乙酸水解减压蒸干后的样品，依次加入10mg的盐酸羟胺和0.5ml无水吡啶，超声溶解，于90℃恒温水浴振荡器中反应40min，反应完成后，冷却至室温，加入0.6ml的乙酸酐，超声混匀，90℃恒温水浴振荡中反应40min，得糖腈乙酰化衍生物，直接进气相色谱仪进行检测；(2)采用气相色谱法分析供试品溶液：色谱柱为Agilent DB‑5毛细管色谱柱，所述色谱柱是30m×0.32mm×0.25μm；燃气、辅助气及载气的比例为N2:H2:Air＝40:45:400ml/min；分流比：10:1；进样量：2μL；进样口温度：220℃；检测器温度：260℃；采用程序升温，其升温程序为：起始温度70℃，保持8min；30℃/min升至160℃，保持19min；10℃/min升至170℃；保持29min；10℃/min升至220℃，保持4min；在此条件下获得样品多糖的色谱指纹图谱，以1号峰为参照，所述1号峰为甘露糖；计算样品中各峰的相对保留时间，以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对面积，最终获得决明子多糖GC标准指纹图谱；所述决明子多糖完全水解下的HPLC标准指纹图谱的构建具体包括如下步骤：(1)完全水解步骤：精密称取粗多糖样品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml，0.5mol/L的TFA溶液，用酒精喷灯封口，置于110℃水解3h，反应完成后，将样品取出，冷却至室温，采用甲醇润洗转移至5mL的离心管中，4000rpm离心5min；取上清液，转溶到圆底烧瓶，50℃减压旋转蒸发至干，用甲醇超声溶解，50℃旋干，重复处理4次以除去残留的TFA，减压蒸干后的样品，备用；(2)决明子多糖水解液的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化过程：将多糖水解物用水溶解，然后转容到10ml容量瓶并定容，准确量取定容好的多糖水解液0.2ml置于5ml具塞玻璃离心管中，依次加入0.2ml，0.5mol/L的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮的甲醇溶液和0.2ml，0.3mol/L的NaOH溶液，超声混匀，70℃水浴反应60min，冷至室温，加0.2ml，0.3mol/L的HCl溶液中和，向离心管中加氯仿至2ml，高速涡旋1min，萃取剩下的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮，4000rpm的转速离心5min，移除下层有机相，保留上清液，采用2mL氯仿重复萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀释定容至5ml，过0.22μm的微孔滤膜，供HPLC检测用；混标样品的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化处理方法与样品液相同，所述混标样品的浓度为0.1mg/ml；色谱条件：色谱柱为C18，所述色谱柱为250×4.60mm，5μ；流动相：18％乙腈—82％磷酸盐缓冲液，所述缓冲液为0.05mol/ml；pH＝6.74；流动相流速为0.8ml/min；柱温为室温；检测器为紫外检测器；检测波长为245nm；进样量：20μL；以1号峰为参照，所述1号峰为甘露糖，计算样品中各峰的相对保留时间，以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对面积；所述决明子多糖不完全水解下的HPLC标准指纹图谱的构建具体包括如下步骤：(1)不完全水解步骤：精密称取粗多糖样品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml，0.05mol/L的TFA溶液，用酒精喷灯封口，置于110℃水解1h，反应完成后，将样品取出，冷却至室温，采用甲醇润洗转移至5mL的离心管中，4000rpm离心5min；取上清液，转溶到圆底烧瓶，70℃减压旋转蒸发至干，用甲醇超声溶解，50℃旋干，重复处理3次以除去残留的TFA，减压蒸干后的样品，备用；(2)决明子多糖水解液的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化过程：将多糖水解物用水溶解，然后转容到10ml容量瓶并定容，准确量取定容好的多糖水解液0.2ml置于5ml具塞玻璃离心管中，依次加入0.2ml，0.5mol/L的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮的甲醇溶液和0.2ml，0.3mol/L的NaOH溶液，超声混匀，70℃水浴反应60min，冷至室温，加0.2ml，0.3mol/L的HCl溶液中和，向离心管中加氯仿至2ml，高速涡旋1min，萃取剩下的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮，4000rpm的转速离心5min，移除下层有机相，保留上清液，采用2mL氯仿重复萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀释定容至5ml，过0.22μm的微孔滤膜，供HPLC检测用；混标样品的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮衍生化处理方法与样品液相同，所述混标样品的浓度为0.1mg/ml；色谱条件：色谱柱为C18，所述色谱柱为250×4.60mm，5μ；流动相：18％乙腈—82％磷酸盐缓冲液，所述缓冲液为0.05mol/ml；pH＝6.74；流动相流速为0.8ml/min；柱温为室温；检测器为紫外检测器；检测波长为245nm；进样量：20μL；以1号峰为参照，所述1号峰为甘露糖，计算样品中各峰的相对保留时间，以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对面积。