一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法

摘要

本发明涉及一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法，属植物组织培养技术领域。该普通野生稻杂交后代花药培养方法包括：外植体的选择，外植体灭菌，花药愈伤的液体悬浮诱导，花药愈伤的增殖培养，花药愈伤组织分化培养，分化苗即花培苗的生根培养，及花培苗炼苗、移栽步骤。本发明将花药接种到液体培养基中进行悬浮培养，提高愈伤诱导率，再将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，提高愈伤质量和数量。本发明的优点在于：能够大幅度提高普通野生稻杂交后代花药培养中愈伤诱导率和成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率；为加速利用野生稻优良基因选育水稻品种提供有力的技术支持。

主权项

一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法，其特征在于该培养方法的具体步骤如下：a.外植体的选择：外植体的选择为田间取材，在晴天早晨露水未干时取幼穗，选取剑叶环和下一叶环之间距离为5‑10cm的稻穗，穗子不破口，保留两片叶和叶鞘；田间取穗后立即放入盛有清水的桶中，以避免穗子失水；在实验室中用体积百分比为70％酒精棉球擦拭叶片和叶鞘，再按照不同株系用保鲜膜包裹幼穗，置于4‑6℃冰箱中低温预处理7‑10天；b.外植体灭菌：取出预处理后的幼穗，挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，即：花药淡黄色，在颖壳内雄蕊长度接近颖片长度的1/2，长粒型的接近2/5的稻穗；将幼穗叶片剥离后用体积百分比为70％的酒精棉球擦拭叶鞘，将枝梗剪为5‑7厘米的段，用体积百分比为70％的酒精浸泡30秒进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗4‑5次，再用质量体积百分比为0.1％的升汞表面消毒8分钟，其间不时上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水冲洗4‑5次；c.花药愈伤的液体悬浮诱导：灭菌后将穗子从苞叶中剥离，放在无菌滤纸上吸干多余的水分，用剪刀剪去颖壳的上部，注意不要剪到花药，用镊子的尖部挑出花药到诱导液体培养基中，每瓶30枚花药；将接种花药的三角瓶放到摇床中28℃、100‑130转/分钟黑暗下悬浮培养，悬浮培养15‑25天直至愈伤组织长出；花药诱导液体培养基为：N6基本培养基+2.4‑D 2.0mg/L+天门冬氨酸1.0g/L+谷氨酰胺1.0g/L+酵母1g/L+蔗糖50g/L，PH为5.8；d.花药愈伤的增殖培养：待三角瓶中悬浮培养的花药愈伤生长至1‑2mm时，用80目已灭菌的筛网过滤，将筛网上的愈伤抖落到增殖培养基上，28℃、继续黑暗培养10‑15天，直至花药愈伤长至3‑5mm进行分化培养；增殖培养基为：MS基本培养基+2.4‑D 2.0mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH5.8。e.花药愈伤组织分化培养：将生长至3‑5mm的愈伤组织转入分化培养基进行光照分化，光照条件为5000‑6000Lux，光照周期为16小时/天，培养温度为28℃，经过20‑30天分化苗长出；分化培养基为：MS基本培养基+6‑BA 3.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH为5.8f.分化苗即花培苗的生根培养：将长至3‑5cm的分化苗转移到装有生根培养基直径2.5cm、长25cm的玻璃管中，光照条件为5000‑6000Lux，光照周期为16小 时/天，培养温度为28℃，经过10‑15天分化苗根长出并长长；生根培养基为：1/2MS基本培养基+0.2mg/L NAA+植物凝胶2.0g/L，PH为5.8；g.花培苗炼苗、移栽：将根系生长较好的花培苗从生根培养基中轻轻拔出，用±28℃的温水洗去根上的培养基，将苗放入市场购买的育苗基质中，28℃‑30℃光照培养7‑15天，待花培苗长势良好时移栽到大田。