一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法

摘要

本发明提供了一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，该方法包括提取癌细胞/正常细胞总RNA；DNase I及RNase I酶切；逆转录成cDNA及双链合成，加接头；抑制性消减杂交，PCR产物克隆建库，测序分析；对候选分子进行进一步实验验证等步骤。经在正常细胞和肿瘤细胞中应用验证，证实该方法可系统、快速的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子。

主权项

一种筛选肝癌相关的自然反义转录子的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）提取人正常肝细胞和肝癌肿瘤细胞总RNA，随后检测所提取的总RNA； 2）分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤1）获得的人正常肝细胞及肝癌肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；4）以随机六引物为引物，用T4 DNA聚合酶催化合成cDNA 第二链并补平末端；5）以Rsa I酶切双链cDNA，时间为2h，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水调整浓度至300ng/μl；6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；驱动子 (Driver) cDNA不连接头； 7）用T4 DNA 聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；8）以正常肝细胞和肝癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以肝癌细胞为检测子，以正常肝细胞为驱动子；在反向消减中, 以正常肝细胞为检测子，以肝癌细胞为驱动子；9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增，两轮PCR扩增循环次数分别为28和12；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM‑T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆后进行测序；11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的转录子。