一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法

摘要

本发明涉及一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，属于核酸转化和纯化技术领域。本发明方法在DNA重亚硫酸盐转化体系中加入一种能够防止DNA片段化而降解的DNA保护剂，使得DNA在重亚硫酸盐处理过程中不至于片段化而降解。进而有效的提高了处理后DNA的质量，使得核酸的回收率达到了70%左右，并且增加了转化后的PCR及其他分析技术的灵敏度。本发明方法使得整个DNA重亚硫酸盐处理过程更加简单，快捷，同时提高了处理后DNA的质量。

主权项

一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）在200微升的离心管中加入5～20微升的待处理DNA溶液，10微升的DNA保护剂以及90微升的DNA重亚硫酸盐转化液，并用去离子水补足反应体积至120微升；其中所述的DNA重亚硫酸盐转化液配方为：四乙基氯化铵：1～2克，重亚硫酸盐：0.3～0.5克，将两种组分称重后溶于去离子水中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值至5.0～6.0，并最终用去离子水定容溶液至1000毫升；其中所述的DNA保护剂为：对苯二酚：2～3克，加去离子水，溶解后定容至1000毫升；（2）对步骤（1）的反应体系进行重亚硫酸盐处理，处理程序为：将反应体系加热至95摄氏度，保温10分钟，降温至64摄氏度，保温60分钟，然后冷却至室温，得到第一溶液；（3）将步骤（2）的第一溶液与结合液充分混合，以增加第一溶液中的DNA与硅膜吸附柱的结合能力，混合比例为：第一溶液:结合液＝1:5，得到第二溶液；其中所述的结合液的配方为：三羟甲基氨基甲烷：11～13克，乙二胺四乙酸二钠：6～8克，将两种组分称量后与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；（4）向硅膜吸附柱中加入500微升平衡液，在12000转/分钟下离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；其中所述的平衡液为：三羟甲基氨基甲烷：11～13克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的pH值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；（5）将第二溶液加入到上述步骤（4）经过平衡处理的收集管内的硅膜吸附柱中，室温放置2分钟，以12000转/分钟离心分离1分钟，倒掉收集管中的废液，将硅膜吸附柱放入收集管中；（6）向步骤（5）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液；其中所述的漂洗液为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；（7）向步骤（6）的硅膜吸附柱中继续加入600微升亚硫酸基团去除液，室温下放置15分钟后进行离心处理，离心的转速为12000转/分钟，离心时间为45秒，倒去废液；其中所述的亚硫酸基团去除液配方为：NaOH：11～13克，无水乙醇：700～800毫升，将两种组分称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；（8）向步骤（7）的硅膜吸附柱中加入600微升漂洗液，室温下静置2分钟，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为12000转/分钟，脱盐离心时间为45秒，倒去废液，重复该步骤一次；（9）对步骤（8）的硅膜吸附柱进行干燥离心，干燥离心的转速为12000转/分钟，干燥离心时间为2分钟，将吸附柱置于室温下2～5分钟，去除吸附材料中的漂洗液；（10）在步骤（9）的硅膜吸附柱中加入20微升无核糖核酸酶的去离子水，室温下放置2分钟后，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为12000转/分钟，洗脱离心时间为2分钟，得到纯化的DNA溶液。