发明名称 | 一种烟粉虱内共生菌菌胞的提取方法 | ||
摘要 | 本发明涉及昆虫内共生菌菌胞的提取方法,具体为一种烟粉虱内共生菌菌胞的提取方法。所述方法包括三个主要步骤,即解剖、过滤、不连续密度梯度离心,通过上述步骤逐层去除,能充分去除外源微生物的干扰,获得较纯、足够量的菌胞,使后续研究内共生菌功能时排除了宿主及其体内外源微生物的影响,进而用于后续内共生菌全基因组的测序、活性物质的分离等试验,能够更全面深入了解烟粉虱内共生菌的功能。 | ||
申请公布号 | CN103387945A | 申请公布日期 | 2013.11.13 |
申请号 | CN201210145628.1 | 申请日期 | 2012.05.09 |
申请人 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 发明人 | 郭建洋;万方浩;赵瑞华;龙楚云 |
分类号 | C12N1/20(2006.01)I | 主分类号 | C12N1/20(2006.01)I |
代理机构 | 北京法思腾知识产权代理有限公司 11318 | 代理人 | 高宇 |
主权项 | 一种提取烟粉虱内共生菌菌胞的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:1)收集烟粉虱成虫,短时浸于含70%乙醇中,静置,收集离心管底部虫体,然后用灭菌双蒸水反复漂洗;2)将消毒后的虫体置于解剖镜下,去除虫体头、胸、中肠组织,并收集剩余组织;3)将步骤2)收集的虫体组织置于PBS缓冲液中,匀浆并研磨成粗样;4)匀浆液分别在60、40、20微米孔径微型过滤器中过滤,收集过滤液,去掉过滤器中的虫体碎片;5)滤液用NaCl稀释成样品,在梯度液Percoll比重1.146‑1.083g/ml范围内进行非连续密度梯度离心,离心力为4~5千克力,离心1小时,进行梯度介质筛选;6)首次离心4000g,离心1小时,然后逐层去除Percoll液,分离获得初次离心的菌胞粗提液,收集不同界面部位的细胞;7)将菌胞粗提液分别加入下一级梯度继续离心,重复步骤6)操作,获得含有Percoll液的菌胞;如果分离层面效果不好,继续重复步骤7),直至层面稳定、单一;8)收集的菌胞在4℃,3,000g条件下离心1小时,回收离心管底部沉淀物,用PBS缓冲液稀释,离心洗涤以去除过多的梯度介质,获得富含菌胞的沉淀物。 | ||
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