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一种大菱鲆T170G单核苷酸多态性标记的检测方法，其特征在于它的方法包括：1）、基因组DNA提取；2）、候选SNP筛选；3）、引物、探针设计；4）、不对称PCR扩增；5）、探针杂交；6）、数据采集；7）、基因分型，具体步骤如下：1）、基因组DNA提取:提取大菱鲆基因组DNA，将其稀释为20ng/μl；2）、候选SNP筛选：采用Vector NTI Advance11综合软件包中的Contig Express模块对大菱鲆EST序列进行聚类、拼接，再利用拼接后的EST重叠群通过人工判读的方式筛查出候选T170GSNP位点，候选T170GSNP位点所在的基因序列为：CCTGAACACTGGAACCTTCACATTATAACACACTGAAGTCAAGAAAAGCAGACAATCCTCTGTAACAGCTTAGTTTTTAATAGATTTGACAAAATCCATATTATTCATACCTGAAAGTGACGCATGAGACGTACAGGGTACCAATAACACAGTATGGTCCGAGTAGTGTTTGTGTGTGTGTGTGTATGAAACAGGAACTACTTTCTAGAAAAAAAACAGTACAGTCACGTGAGTGCTAGGTGAGTTATTCTGTTTTCTGCTGT，其中加粗、加下划线的碱基即为候选T170GSNP位点；3）、引物、探针设计：在候选T170GSNP位点两端设计特异性引物，目的片段长度小于350bp，引物设计用Primer5.0，参数分析用Oligo7.0；根据候选T170GSNP位点设计3’端封闭非标记探针，探针的退火温度范围为60℃‑80℃，探针3’端采用2碱基错配封闭，探针序列为5’‑ACACACAAACACTACTCGGACTT‑3’；特异性引物正链为：5’‑CCTGAACACTGGAACCTT‑3’，负链为：5’‑TACAGCAGAAAACAGAATAACT‑3’，引物退火温度54℃；4）、不对称PCR扩增：使用候选T170GSNP对应引物对步骤1所提取的大菱鲆基因组DNA进行不对称PCR扩增；不对称PCR反应体系为15μl，包括20ng/μl大菱鲆基因组DNA1μl，10×PCR buffer1.5μl，2.5mMdNTPs各1.2μl，25mMMgCl21.2μl，5U/μl Taq DNA polymerase0.075μl，1×LC Green Plus1.5μl，10μM正链引物1.2μl，2μM负链引物1.2μl，加ddH2O至15μl；设置PCR仪的程序为95℃变性5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃ 30sec，60个循环；72℃延伸7min，4℃保存；5）、探针杂交：将不对称PCR扩增产物与3’端封闭的非标记探针进行杂交，杂交体系为每个不对称PCR反应体系中加入10μM对应位点的3’端封闭的非标记探针1.5μl；设置PCR仪的杂交程序：变性温度95℃10min，之后自然降至室温，置4℃保存；6）、数据采集：将杂交产物置于Light Scanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采集，采集曲线的温度范围为45℃至97℃，每摄氏度获得10个点，升温速度为0.1℃/s；7）、基因分型：数据的检索和分析运用Light Scanner分析软件，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。 |
