一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用

摘要

本发明涉及一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。主要步骤包括：小麦种植后，选择合适的转化时期，所述转化时期选择在小麦抽穗前约10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm左右时；将含有目的基因的农杆菌菌液活化、重悬后注入旗叶包被的幼穗，整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作。对操作人员的技术要求低，易于掌握，可以简单、快速、高效地获得转基因植株，排除体细胞无性系变异对转基因植株的影响，克服小麦基因型对农杆菌转化的限制，对于小麦基因功能的验证及基因工程育种具有重要的作用及广阔的应用前景。

主权项

一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法，其特征在于，小麦种植后，选择合适的转化时期，所述转化时期选择在小麦抽穗前10～15d，小麦旗叶全部抽出，叶环距2～5cm时；将含有目的基因的农杆菌菌液活化、重悬后注入旗叶包被的幼穗，整个幼穗注射过程可以在大田或温室中进行，无需在无菌条件下操作；所述含有目的基因农杆菌的活化与重悬后注入旗叶包被的幼穗具体操作如下：挑取YEP固体培养基平皿上带有目的基因和/或选择标记基因，或T‑DNA区含有目的基因和/或选择标记基因的根癌农杆菌单菌落，接种于含附加抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养，经2‑3次活化，当菌液OD600至1.2左右时，4℃、7000rpm离心5分钟收集菌体，去掉上清液，用含终浓度为200μM的乙酰丁香酮的的1/2MS营养液悬浮菌体至OD600约为0.6，加入终浓度为0.02％的Silwet L‑77，即可用于转化；将重悬的菌液用注射器从顶部注入旗叶包被的幼穗处，每穗100‑200μl；所述的根癌农杆菌是带有目的基因的GV3101或C58C1菌株；筛选剂筛选是在T0和T1代苗期进行，分子生物学鉴定是在T1代苗期进行。