一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法

摘要

一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法，本发明利用生化的方法提供了一种绵羊抗菌肽的分离、提纯方法，该抗菌肽是一种单链的多肽，其分子量是4820.47Da。等电点为6.96，呈酸性。本发明制取的抗菌肽具有热稳定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革兰氏阳性、阴性和真菌的生长，且具有分离提纯工艺快速、高效，回收率高等特点，可广泛用于兽药、防腐剂、医药产品等领域。

主权项

一种抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法，其特征在于由以下方法来实现；样品处理：将100‑200g绵羊生殖道剪碎成0.5‑1.2cm2的小块，9000‑12000r/min 离心5‑20min，零下10‑20℃冻融3‑4次，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，按1:1.5‑3体积比加入浓度为5‑30%乙酸，在3‑5℃搅拌浸提20‑26h，然后在3‑5℃时，将浸提混合物在高速冷冻离心机上用10000‑15000r/min离心20‑30min，收集上清透析，测定蛋白浓度，冷冻干燥，零下10‑20℃低温保存，取0.1‑1mg重新溶解在浓度为0.01‑0.05% 乙酸中用于检测活性；抗菌肽初级分离：用凝胶过滤色谱方法进行初级分离：在室温下将48‑53.0g交联葡聚糖凝胶G‑50溶解于480.0‑530.0 mL去离子水中膨胀20‑26h，采用真空泵脱除凝胶中气体后，进行装柱使其成φ 1cm × 15‑100 cm柱，先用0.15‑0.25N氢氧化钠清洗液冲洗2‑4h，再 用浓度为 0.1‑0.05mol/L ，pH 值为5‑7的乙酸铵洗脱液平衡柱子，将样品重悬在上述洗脱液中，以9000‑12000 r/min离心10‑20min，取上清上样, 洗脱流速18‑20 mL/ h，收集目的峰，整个洗脱过程在0‑10℃环境中进行，用吸光值200‑300nm检测洗脱峰，收集后冷冻干燥，重新溶解在浓度为0.01‑0.05% 乙酸中，测定蛋白浓度、检测抗菌活性；抗菌肽的精分离：用反相高效液相色谱方法进行精分离：将凝胶过滤色谱有抗菌部分进行第二步分离纯化，将样品重悬在浓度为0.01‑0.05％乙酸洗脱液中，在0‑10℃以9000‑12000 r/min离心10‑20min，取上清上样于反相高效液相色谱柱，柱长为20‑100 cm ，用含浓度为0.08‑0.11％三氟乙酸的水和含浓度为0.08‑0.11％三氟乙酸的乙腈按990~999:1~10的体积比构成的洗脱液进行梯度洗脱，吸光值200‑300nm检测洗脱峰，收集冷冻干燥。