魔芋软腐病病原菌分子快速检测的方法

摘要

本发明公开了一种魔芋软腐病病原菌分子快速检测的方法，其步骤是：A.取冻存魔芋软腐病病原菌和其他致病菌扩大培养，划线后挑取单菌落接种于营养肉汤培养基；B.利用细菌通用引物扩增魔芋软腐病病原菌基因组，序列测定；C.根据基因库中欧文氏杆菌的基因序列及分离测序所得的魔芋软腐病病原菌基因序列，设计引物；D.将提取的魔芋软腐病病原菌基因组检测；E.将软腐病病原菌PCR扩增产物回收，连接转化，提取质粒；F.用分光光度计测量菌液浓度，确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌灵敏度；G.将有软腐病症状的魔芋在吐温-20中浸泡过夜，离心，沉淀，无菌水溶解。该方法易行，操作方便，成本低，可应用于魔芋生产中种芋质量监控。

主权项

1、一种魔芋软腐病病原菌分子快速检测的方法，其步骤是：A、细菌的培养：取冻存魔芋软腐病病原菌和致病菌扩大培养，划线后挑取单菌落接种于营养肉汤培养基，27-30℃培养过夜后挑取单菌落接种于NB培养基中，27-30℃摇床培养过夜后待用；B、获得魔芋软腐病病原菌基因序列：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取魔芋软腐病病原菌基因组，用细菌通用引物：P1：5’-AGA CTT TGA TCC TGGCTC AG-3’，P2：5’-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TTC-3’进行PCR扩增，反应体系为25μl：10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸2μl，20mMol的氯化镁2μl，pH8.3-8.8缓冲液2.5μl，蒸馏水16μl，加10μM的引物P1和P2各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反应条件是：95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃1.5min，循环35次；72℃10min，PCR产物以1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到1500bp的条带，将软腐病病原菌基因组PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后，菌液用M13：5′-GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACGA-3′，5′-GAG CGG ATAACAATT TCA CAC AGG-3′进行PCR扩增，凝胶电泳检测，将检测后确认含有目的片段的阳性克隆，获得软腐病病原菌基因序列；C、荧光定量PCR特异引物设计：根据基因库中欧文氏杆菌公布的16S rDNA基因序列以及分离测序所得的魔芋软腐病病原菌基因序列与致病菌的差异，使用Primer5软件设计荧光定量PCR特异引物F：5′-ATG CAA CGC GAA GAT CCTTAG GTAC-3′，R：5′-CATTGAAGC ACG TGTCTAGCC CTAC-3′，该引物扩增的目的片段长度为228bp；D、引物特异性检测：细菌基因组DNA提取试剂盒提取的魔芋软腐病病原菌基因组DNA和致病菌的基因组DNA进行F、R引物特异性检测，PCR反应体系为25μl：10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸2μl，20mMol的氯化镁2μl，pH8.3-8.8缓冲液2.5μl，蒸馏水16μl，加10μM的引物F和R各0.5μl，2u/μl的Taq酶1μl，模板0.5μl，反应条件是：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，循环35次，PCR产物以1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测设计引物的特异性；E、确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌的标准曲线：将软腐病病原菌PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后，菌液用M13：5′-GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG A-3′，5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCACAC AGG-3′引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后确认含有目的片段的阳性克隆并进行DNA序列测定，测序结果与已知序列比对正确后，用质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒10倍梯度稀释溶液分别作为荧光定量PCR反应模板，确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌的标准曲线；F、确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌灵敏度：用分光光度计测量菌液浓度，将菌液浓度为108CFU/ml依次10倍稀释，并取90ml涂平皿，103CFU/ml有33个菌落，104CFU/ml有328个菌落，105CFU/ml菌落无法计数，以107CFU/ml-102CFU/ml的6个稀释梯度进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR反应，确定荧光定量PCR检测魔芋软腐病病原菌的标准曲线；G、荧光定量PCR的应用：将有软腐病症状的魔芋在吐温-20中浸泡过夜，浸泡液在16000r/min，4℃条件下离心20min，沉淀用10μL无菌水溶解，取1μL作为模板用荧光定量PCR标准曲线对其进行定量分析，应用于生产。