红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法

摘要

本发明涉及红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。它采用红曲米的液态发酵，有机溶剂沉淀，低温离心方法，真空冷冻干燥，Sephadex G-75凝胶柱层析，DEAE-纤维素52层析的步骤。本发明通过低廉原材料制备出高活性的凝乳酶，可以极大地解决凝乳酶来源不足的问题。

主权项

1、一种红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：1)红曲米粉碎成粉状，细度200—400目，将红曲米粉接种到PDA斜面培养基，28-30℃恒温培养90-96h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周；2)将红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，28-30℃恒温培养12h进行扩大培养；3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按5％(体积比)接种量加入液体培养基进行摇床培养，28-30℃，150r/min摇床培养70—72小时，得到的红曲霉活化液；4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按照体积百分比5％的接种量接种至发酵罐，通风量20—40L/min，培养温度28—32℃，转速200—350r/min，培养时间72—120h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液；5)将步骤4)发酵的得到的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；6)向步骤5)得到的上清液中分两次滴加2—3倍体积的乙醇进行醇沉，第一次4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，用旋转蒸发仪浓缩，第二次4℃静置24h后，以8000r/min离心15min，取沉淀，合并两次沉淀且溶于pH6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。